PPBIOTEC - Doutorado (Teses)

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Potencial biotecnológico de bactérias associadas a plantas do Quadrilátero Ferrífero.
(2017) Felestrino, Érica Barbosa; Moreira, Leandro Marcio; Moreira, Leandro Marcio; Santos, Vera Lúcia dos; Fietto, Luciano Gomes; Cota, Renata Guerra de Sá; Silva, Silvana de Queiroz
A ciclagem de nutrientes, a promoção do crescimento de plantas, a biorremediação de ambientes poluídos e o controle biológico de pragas e doenças vegetais são algumas das funções que residem em meio à diversidade genética e metabólica dos microrganismos do solo e associados a plantas. O crescimento vegetal muitas vezes está relacionado à capacidade de alguns microrganismos solubilizarem fosfatos minerais ou outros nutrientes do solo e produzir ou aumentar a concentração de hormônios vegetais como ácido indol acético, ácido giberélico, citocininas e etileno ou ainda fixar nitrogênio associativamente. Alguns desses microrganismos controlam organismos fitopatogênicos provenientes do solo ou das sementes através da produção de sideróforos, 1,3-glucanase, quitinases, ácido cianídrico e antimicrobianos. Outros são responsáveis pela remediação de solos contaminados e assim permitem o crescimento de plantas em ambientes antes inóspitos. Sob tal perspectiva, o objetivo do trabalho foi isolar bactérias associadas a plantas do Quadrilátero Ferrífero (QF) e analisar o potencial biotecnológico relacionado à biofertilização, biocontrole e biorremediação. Dentre todas as plantas analisadas, um total de 307 bactérias foram isoladas, sendo muitas dessas capazes de produzir compostos classificados como promotores de crescimento vegetal. Algumas bactérias foram capazes de inibir patógenos humanos e de plantas. Do total, oito bactérias foram capazes de resistir e remediar ambientes contaminados com arsênio. Alcaligenes faecalis Mc250 foi um dos isolados que apresentou destacado potencial biorremediador, resistindo a 5 e 800mM de arsenito e arsenato, respectivamente, além de remover mais de 50% desse metal do meio. Análises genômicas desse isolado comprovaram suas adaptações ao ambiente hostil de origem. Os resultados demonstram a importância biológica de plantas brasileiras do QF como reservatórios de microrganismos com potencial biotecnológico.
Efeito da Angiotensina-(1-7) na função moduladora do miRNA-1914-5p e elementos reguladores do metabolismo de lipídio no processo fibrosante hepático em células LX-2.
(2017) Silva, Brenda de Oliveira da; Moraes, Karen Cristiane Martinez de; Moraes, Karen Cristiane Martinez de; Torsoni, Adriana Souza; Freitas, Renata Nascimento de; Alves, Stênio Nunes; Borges, William de Castro
A fibrose hepática é o mecanismo de cicatrização e reparo do fígado quando este sofre algum tipo de lesão. Entre os elementos que atuam metabolicamente no desenvolvimento da fibrogênese hepática temos a célula estrelada hepática e esta pode ser encontrada em dois fenótipos: quiescente e ativado. Atualmente existem poucas opções eficazes na reversão do quadro fibrótico e além disso, os detalhes dos mecanismos moleculares da fisiopatologia da fibrose não são bem conhecidos. Assim, elucidar particularidades moleculares, bioquímicas e fisiológicas deste processo torna-se crucial no desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas. Particularmente, a linhagem celular humana, LX-2, vem sendo utilizada como um modelo de estudo da fibrose hepática e, interessantemente, o peptídeo Angiotensina-(1-7) [Ang-(1-7)] se desponta como um importante regulador da pressão arterial, da homeostasia dos fluidos e alguns estudos apontam o seu efeito modulador no processo fibrosante hepático. Dentro do contexto, miRNAs vêm se tornando um novo alvo de investigação e representam uma nova possibilidade de terapia. Diante do exposto, o presente trabalho investigou elementos moduladores do metabolismo de lipídio e da transdiferenciação da célula hepática estrelada LX-2cultivadas sob diferentes condições em diferentes condições: quiescente, ativada, tratadas com Ang-(1-7) e transfectadas com inibidor e mímico do miR-1914-5p. As análises de microscopia e de expressão gênica apontam uma forte conexão dos efeitos moduladores da Ang-(1-7) para regulação do processo fibrosante, via atuação sistêmica no metabolismo lipídico, pela funcionalidade do miR- 1914-5p. Em resumo, os resultados reforçam a contribuição da Angiotensina-(1-7) na reversão do processo fibrosante hepático LX-2 com destaque-se para o miR-1914-5p como uma molécula expoente nesse controle.
Funcionalização de nanobastões de ouro para diagnóstico da paracoccidioidomicose.
(2017) Ferreira, Cyntia Silva; Silva, Breno de Mello; Silva, Breno de Mello; Carvalho, Andréa Teixeira de; Sousa, Edésia Martins Barros de; Santos, Orlando David Henrique dos; Cota, Renata Guerra de Sá
A paracoccidioidomicose (PCM) é uma micose granulomatosa sistêmica causada por duas espécies de um fungo termodimórfico: Paracoccidioides brasiliensis e Paracoccidioides lutzii. A doença é endêmica na América Latina e está associada a fatores sociais e econômicos. Embora a maioria das formas clínicas seja assintomática, podem ocorrer infecções severas e progressivas, envolvendo o tecido pulmonar e até mesmo o sistema nervoso central. Desse modo, sem uma intervenção terapêutica específica, o quadro da maioria dos pacientes acaba evoluindo para o óbito. Apesar da relevância da doença, não existe ainda um diagnóstico rápido e preciso com custo apropriado para as áreas endêmicas. Nesse sentido, uma alternativa é representada pelo uso de nanobastões de ouro (AuNBs), os quais possuem uma forte absorção característica no espectro visível (ressonância de plasmon) que pode ser monitorada por espectrofotometria. Considerando o uso dos AuNBs como biosensores, os mesmos foram funcionalizados com ácido lipóico ou polietilenoimina (ligantes contendo grupos carboxílicos ou aminas livres que permitem a ligação com proteínas antigênicas ou imunoglobulinas, respectivamente). Tais conjugados foram testados na presença dos alvos purificados e também desafiados com soro de pacientes saudáveis e com paracoccidioidomicose comprovada, e soro de camundongos infectados. A ligação efetiva das biomoléculas em questão foi observada através do deslocamento do pico de absorção plasmônica longitudinal dos AuNBs, sendo satisfatórias quando empregadas as biomoléculas purificadas e quando desafiados com soro de camundongos infectados, para a detecção de antígenos. Esses resultados mostram que o sistema deve ser aprimorado para a detecção tanto de antígenos como de anticorpos em soro humano. O deslocamento observado para as biomoléculas purificadas e com o soro de camundongos pode justificar em parte, o sucesso do sistema de detecção proposto, já destacado pela literatura com outros tipos de biomoléculas, e coloca os AuNBs funcionalizados obtidos nesse trabalho como biosensores úteis para o estudo e desenvolvimento de novas abordagens de diagnóstico para a paracoccidioidomicose. Além disso, representa um avanço biotecnológico para o diagnóstico de doenças negligenciadas.
Síntese e funcionalização de nanopartículas inalatórias e avaliação in vitro para tratamento de tuberculose.
(2018) Carneiro, Simone Pinto; Santos, Orlando David Henrique dos; Fattal, Elias; Santos, Orlando David Henrique dos; Faraco, André Augusto Gomes; Rúbio, Karina Taciana Santos; Ferreira, Lucas Antônio Miranda; Cota, Renata Guerra de Sá
A tuberculose é uma doença bacteriana infecciosa considerada um grave problema de saúde pública, por ser classificada como a principal causa de morte no mundo por um único agente infeccioso. A OMS recomenda um protocolo de tratamento eficaz, porém, a terapia convencional requer a administração de altas doses diárias de cada medicamento pela via oral para uma resposta satisfatória do paciente, o que culmina na emergência de efeitos adversos graves, reduzindo a adesão à terapia. Neste contexto, o objetivo deste trabalho é sintetizar e funcionalizar nanopartículas inalatórias destinadas ao tratamento de tuberculose e avaliar, in vitro, suas propriedades físico-químicas, toxicidade e atividade biológica. O trabalho empregou estratégias distintas para o desenvolvimento de nanopartículas contendo fármacos antituberculosos. Uma das estratégias consistiu na aplicação de uma metodologia físico-química, em que carreadores lipídicos nanoestruturados de rifampicina foram obtidos pelo método da microemulsão. Esta nanoformulação foi funcionalizada com um peptídeo modificado baseado na sequência da tuftsina, o qual foi previamente sintetizado em fase sólida e, em seguida, acoplado à superfície das nanopartículas para vetorizar o carreador (NP-pRIF). As nanopartículas foram caracterizadas, confirmando a obtenção de um sistema de liberação monodisperso e estável. Os ensaios em cultura de células demonstraram que a NP-pRIF apresentou um potencial de internalização pelos macrófagos significativamente maior que as nanopartículas de rifampicina sem o peptídeo (NP-RIF). Os estudos de citotoxicidade constataram o potencial não-citotóxico de ambas as formulações (NP-pRIF e NP-RIF) em todas as concentrações testadas. Ainda, a eficácia da formulação foi testada frente ao Mycobacterium tuberculosis e apresentou uma concentração inibitória mínima 2 vezes menor que a requerida por uma solução do fármaco puro. Para viabilizar a administração pulmonar, as suspensões de nanopartículas foram acrescidas de manitol e submetidas à secagem por atomização por spray-drying, dando origem a um pó fino, fluido e caracterizado por microscopia eletrônica de varredura como micropartículas esféricas, com tamanho de partícula entre 2 – 10 μm. Os testes in vitro demonstraram o potencial de redispersão das micropartículas em água e liberação das nanopartículas alojadas em seu interior. A outra estratégia abordada neste trabalho envolveu o emprego de uma metodologia química para proceder à síntese de dois conjugados constituídos por um fármaco antituberculoso (rifampicina ou ácido pirazinoico) e o poli(ácido málico), através de reações de esterificação. Em seguida, os conjugados se auto-agregaram em água para a obtenção dos respectivos nanoconjugados (NC-RIF e NC-PA, respectivamente), confirmados pelas imagens de microscopia eletrônica de transmissão. Os testes em cultura de células demonstraram que ambos os nanoconjugados foram eficientemente internalizados pelos macrófagos e que as formulações não apresentaram potencial citotóxico para a maioria das concentrações testadas. Estas formulações serão futuramente secas em spray-drying para obtenção de micropartículas e viabilização da administração pulmonar. Em conclusão, ambas as estratégias empregadas neste trabalho foram eficientes na obtenção de nanocarreadores inovadores e com potencial para contribuição na otimização do tratamento da tuberculose.
Bioprospecção de bactérias de regiões de canga do Quadrilátero Ferrífero : estratégia de busca de alvos com potencial biotecnológico.
(2018) Caneschi, Washington Luiz; Moreira, Leandro Marcio; Moreira, Leandro Marcio; Silva, Cynthia Canêdo da; Teixeira, Mônica Cristina; Almeida Junior, Nalvo Franco de; Silva, Silvana de Queiroz
O extrativismo mineral na região do Quadrilátero Ferrífero brasileiro destruiu grandes áreas de terra, dizimando espécies vegetais e sua microbiota associada. Pouco se sabe sobre a microbiota da região. Assim bactérias cultiváveis associadas a plantas e de solos foram investigadas por seu potencial biotecnológico. Amostras foram coletadas de nove espécies de plantas e seis amostras de solos, sendo 65 isolados bacterianos cultiváveis obtidos. Estes representam predominantemente bacilos gram-positivos (70%) capazes de produzir amilases (55%), proteases (63%), celulases (47%), ácido indolacético (AIA) (46%), sideróforos (26%) e solubilizar fosfato (9%). Além disso, 65% destes foram resistentes à ampicilina, 100% eram sensíveis à tetraciclina e 97% tolerantes a altas concentrações de arsênio. Três isolados foram estudados ainda: o isolado FOB3 (Rosenbergiella sp.) produziu altas concentrações de AIA in vitro na ausência de triptofano, demonstrado pela melhora na germinação de planta e taxa de crescimento onde o isolado estava presente. Os isolados C25 (Acinetobacter sp.) e FG3 (Serratia sp.), tiveram plasmídeos extraídos e inseridos em células de E. coli, onde modificaram o perfil fisiológico das cepas transformadas. A cepa E. coli :: pFG3B apresentou a maior capacidade de produção de biofilme, além de aumento na taxa de replicação, tolerância ao arsênio e atividade de catalase, além de aumentar a integridade do DNA na presença de arsênio. A cepa Serratia sp. teve seu genoma completo sequenciado pela plataforma PacBio sendo identificada como Serratia liquefaciens cepa FG3 (SlFG3). Foi identificado um cromossomo de 5,7 Mpb (5398 genes) e dois plasmídeos com 159 Kbp (179 genes) e 125 Kpb (146 genes). A análise comparativa do genoma de SlFG3 foi realizada com 33 outras espécies de Serratia com genomas completos e revelou a presença de 18 supostas inserções de fagos, permitindo identificar 311 genes únicos para o SlFG3 e um core genome de 417 famílias de proteínas. A análise filogenômica baseada no core genome permitiu agrupar SlFG3 em um clado com outras três linhagens de S. liquefaciens (FDAARGOS125, HUMV21 e ATCC27592) e Serratia proteamaculans 568 (Sp568), que compartilham um core de 3998 famílias de proteínas ortólogas. Entre esses cinco genomas, 75 genes são compartilhados apenas em SlFG3 e S. protemaculans 568, ambos isolados de plantas, e 643 famílias de proteínas são exclusivas de SlFG3. A análise desses genes revelou a presença de uma via completa relacionada à degradação de protocatecuato e compostos cloroaromáticos. Além disso, SlFG3 possui um repertório diversificado de genes associados a NRPs / PKS, um conjunto completo de síntese de celulose e metabolismo oxidativo completo e reparo de DNA. Finalmente, SlFG3 ainda possui genes relacionados à tiolação de RNA e DNA, inserida em uma região de fago que pode proteger os ácidos nucléicos contra diferentes condições de estresse. Esses achados resumem que o SlFG3 parece estar bem adaptada à diferentes situações de estresse impostas por condições extremas além de ser extremamente interessante no estudo de mecanismos molecularese composição gênica que pode ser melhor explorado com alto potencial biotecnológico.
Análise proteômica da espécie exótica invasora Limnoperna fortunei para fins de prospecção de alvos para o controle e monitoramento.
(2018) Sanson, Ananda Lima; Borges, William de Castro; Borges, William de Castro; Sant'Anna, Eneida Maria Eskinazi; Ruiz, Jeronimo Conceição; Borges, Marcia Helena; Silva, Silvana de Queiroz
A espécie invasora de origem asiática Limnoperna fortunei, conhecida como mexilhão dourado, foi identificada pela primeira vez no Brasil em 1998 no Rio Grande do Sul e, deste então, vem provocando grandes danos econômicos e ambientais, tais como paradas de turbinas em hidrelétricas, entupimento de tubulações, morte de peixes, etc, principalmente por sua capacidade de fixação e proliferação. Neste contexto, o desenvolvimento de métodos capazes de propiciar sua caracterização com vistas ao controle das formas larvais e adultas é de grande interesse econômico, científico e tecnológico. Desde 2014 iniciativas como a elucidação do transcriptoma, genoma mitocondrial e mais recentemente da disponibilidade de dados genômicos dessa espécie tem permitido a aplicação de ferramentas moleculares que permitem estabelecer relações de expressão gênica diferencial frente a exposição a condições ambientais ou agentes diversos. Nesse trabalho, nós reportamos a identificação de 3.233 proteínas de L. fortunei via análise em larga escala (shotgun) empregando-se a cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas (LC-MS/MS). Proteínas de interesse tais como aquelas relacionadas a processos secretórios do parasito bem como vários receptores de membrana representam novos alvos passíveis de intervenção para o controle da espécie. Atenção particular foi dada às subunidades do proteassoma identificadas nesse trabalho. Esse complexo proteolítico é o principal responsável por degradação intracelular de proteínas em eucariotos e constitui alvo interessante para ação de drogas que modulam sua atividade. Neste contexto, o proteassoma 20S de L. fortunei foi obtido em grau satisfatório de homogeneidade e suas atividades peptidásicas avaliadas por meio de peptídeos fluorogênicos. Análises de LC-MS/MS permitiram a identificação de 13 das 14 subunidades que compõem a porção catalítica do proteassoma 20S. Ademais, os dados de proteômica permitiram confirmar a expressão dos principais representantes do sistema proteolítico de degradação intracelular dependente de ubiquitina e proteassoma 26S em L. fortunei. A última abordagem desse trabalho consistiu no bioensaio com a exposição do molusco a diferentes concentrações do moluscicida niclosamida (0,25 a 8,0 mg.L-1) para avaliação das alterações proteômicas induzidas. Ao todo, 46 proteínas diferencialmente expressas entre os indivíduos dos grupos controle e teste foram apontadas. Os resultados obtidos com esta abordagem constituem o primeiro inventário do proteoma expresso da espécie invasora L. fortunei e podem contribuir com a proposição racional de novos alvos moleculares para programas de controle e monitoramento desse bioinvasor.
RNAs não codificadores longos em Schistosoma mansoni : predição e perfil de expressão diferencial no estágio evolutivo de verme adulto.
(2018) Oliveira, Victor Fernandes de; Cota, Renata Guerra de Sá; Cota, Renata Guerra de Sá; Freitas, Henrique Cota de; Moreira, Leandro Marcio; Gomes, Matheus de Souza; Borges, William de Castro
A esquistossomose é considerada uma doença debilitante de grande impacto socioeconômico no mundo causada por platelmintos do gênero Schistosoma. Uma das principais espécies identificadas nesse gênero é o parasita Schistosoma mansoni, que apresenta um ciclo de vida bastante complexo. Acredita-se que a complexidade dos programas de diferenciação e desenvolvimento observado entre os diferentes estágios evolutivos e ambientes onde o parasita vive seja dependente da regulação da expressão gênica. Os RNAs não codificantes representam uma das principais classes de moléculas que potencialmente controlam a regulação gênica nos níveis: epigenético, transcricional, pós-transcricional e traducional. Esses RNAs são divididos em dois grandes grupos, os RNAs pequenos não codificantes de proteína e os RNAs longos não codificantes (lncRNAs), o foco desse projeto. Os lncRNAs correspondem aos transcritos com mais de 200 nucleotídeos e que não codificam proteínas. Particularmente, estão envolvidos em diversas funções regulatórias celulares, como regular a transcrição, induzir o remodelamento da cromatina e modificações em histonas, originar siRNAs endógenos, modular atividades de proteínas, alterar a localização celular de proteínas, ser precursores de pequenos RNAs, entre outros. A hipótese desse trabalho é que o S. mansoni expresse um conjunto de lncRNAs de forma diferencial através da reprogramação de sua expressão gênica em determinados estágios evolutivos. Para investigá-la foi utilizado um conjunto de dados de RNA-seq disponível para a fase adulta do parasito objetivando: (i) a montagem de um pipeline para identificar e caracterizar lncRNAs a partir de dados de RNA-seq com alta confiança; (ii) classificar os novos lncRNAs preditos utilizando a anotação Gene Ontology; (iii) analisar a expressão de um conjunto de 20 lncRNAs em cercária, esquistossômulos com 3,5h de cultivo in vitro, machos, fêmeas, casal e ovos; (iv) analisar a expressão de lncRNAs em parasitos resistentes ao praziquantel e (v) analisar a expressão de lncRNAs em fígado de camundongo infectado e não infectado com S. mansoni. Foram identificados 170 novos Sm-lncRNAs com termos de ontologia relacionados ao metabolismo, transporte e biossíntese. Quinze dos preditos lncRNAs mostraram expressão diferencial nos estágios avaliados, bem como entre machos e fêmeas. Alguns apresentaram expressão diferencial em parasitos com resistência ao praziquantel e em fígado de camundongos infectados. Esses achados abrem novas perspectivas para estudos funcionais focados em resistência a essa droga e desenvolvimento de biomarcadores específicos para a esquistossomose.
Análises genômicas para otimização da produção de compostos aromatizantes por estirpe de Saccharomyces cerevisiae isolada de produção de cachaça.
(2018) Araújo, Thalita Macedo; Brandão, Rogélio Lopes; Diniz, Raphael Hermano Santos; Mendes, Tiago Antônio de Oliveira; Borges, William de Castro; Fietto, Luciano Gomes; Brandão, Rogélio Lopes; Andrade, Milton Hércules Guerra de
A qualidade das bebidas alcoólicas está intimamente relacionada à presença de concentrações equilibradas de compostos voláteis, subprodutos do processo de fermentação alcoólica e altamente influenciados pela linhagem da levedura utilizada de tal modo que a compreensão das bases moleculares da produção de compostos desejáveis represente a possibilidade do incremento da qualidade de bebidas fermentadas visando a agregação de valor ao produto final. O presente trabalho tem como objetivo realizar uma análise de características genéticas e fisiológicas das leveduras isoladas da produção de cachaça com potencial para aplicação na produção de outras bebidas alcoólicas. Desse modo, 118 linhagens da coleção LBCM foram avaliadas quanto a capacidade de metabolização de maltose, produção de baixas concentrações de sulfeto de hidrogênio, capacidade de transporte de maltotriose e capacidade de produção de compostos voláteis. A despeito de sua origem comum, as leveduras avaliadas apresentaram diferenças significativas em sua fisiologia. Algumas dessas leveduras apresentam potencial biológico para aplicação na produção de outras bebidas, como, por exemplo, cerveja. A linhagem LBCM1073 foi selecionada dentre as demais por ser heterotálica e pela sua capacidade de produção de acetato de isoamila, um éster altamente desejável em diversas bebidas alcoólicas. Após sequenciamento genômico dessa levedura, com cobertura de 263 vezes e a predição de 5686 genes, análises de genômica comparativa revelaram que a linhagem LBCM1073 apresenta um conjunto de 24 genes ausentes na linhagem laboratorial S. cerevisiae S288c. Alguns desses genes apresentam similaridade com S. bayanus e Lachancea sp. Um total de 64,15% dos genes da linhagem LBCM1073 apresenta ortólogos com genes de 40 ascomicetos avaliados. Dentre as vias já mencionadas na literatura como relacionadas à produção de compostos voláteis, a via de sinalização mTOR e a glicólise, são as que apresentaram maior percentual de genes ortólogos, justificado pela ampla distribuição dessas duas vias dentre os organismos utilizados para análise. Ao serem comparadas as sequências de aminoácidos de 34 enzimas,relacionadas à produção de compostos responsáveis por aromas, 13 foram idênticas entre LBCM1073 e S. cerevisiae S288c. Para as demais, as proteínas codificadas por LEU4, PMA1, RSP5, TOR1 e FAS2 não apresentaram as substituições descritas na literatura como relacionadas à maior produção de compostos on flavour. Em conjunto, esses dados mostram que LBCM1073 e S. cerevisiae S288c apresentam diversas distinções a nível genômico. Uma metodologia capaz de contribuir para melhor elucidar essas diferenças em relação à produção de compostos secundários à fermentação é a técnica de BSA (Bulked Segregants Analisys) ou análise de agrupamentos de segregantes. As análises fenotípicas de segregantes obtidos do cruzamento entre LBCM1073 e S. cerevisiae S288c revelou uma discreta relação direta entre a capacidade de conversão de álcool isoamílico em acetato de isoamila e o crescimento na presença de TFL 0,5 mM. Além disso, os segregantes já obtidos e avaliados poderão ser empregados na análise de QTLs envolvidos na produção de acetato de isoamila.
Inovações na produção de enzimas do fungo Chrysoporthe cubensis e seus reflexos na sacarificação do bagaço de cana-de-açúcar.
(2018) Albuquerque, Mariana Furtado Granato de; Rezende, Sebastião Tavares de; Guimarães, Valéria Monteze; Rezende, Sebastião Tavares de; Almeida, Maíra Nicolau de; Andrade, Milton Hércules Guerra de; Monteiro, Paulo Sérgio; Brandão, Rogélio Lopes
O presente trabalho avaliou o efeito de métodos de pré-tratamento, ainda não testados, na hidrólise do bagaço de cana realizada com coquetéis enzimáticos fúngicos produzidos on-site. Além disso, o extrato enzimático de C. cubensis foi melhorado, por meio de alterações em suas condições de cultivo, e as enzimas α-arabinofuranosidases desse fungo foram purificadas, caracterizadas e avaliadas na hidrólise do bagaço de cana-de-açúcar pré-tratado alcalino. Os melhores resultados mostraram que o prétratamento hidrotérmico permitiu a conversão de mais de 60% da glicana pelo blend enzimático C. cubensis-P.pinophilum, além de diminuir a necessidade de hemicelulases no processo. O farelo de trigo se destacou, em relação ao capim elefante e ao bagaço de cana-de-açúcar, como fonte de carbono no crescimento do C. cubensis. O melhor extrato enzimático, obtido a partir do crescimento do fungo em uma mistura do farelo de trigo e farinha de beterraba, na proporção 1:1, se mostrou mais completo e eficiente na sacarificação do bagaço de cana submetido ao pré-tratamento ácido ou alcalino, se comparado ao extrato enzimático obtido com farelo de trigo puro. A partir desse coquetel, foram purificadas e caracterizadas duas α-arabinofuranosidases, denominadas α-Ara1 e α-Ara2. As duas enzimas foram satisfatoriamente estáveis a 50 °C, com meiavidas de 68 e 77 horas, respectivamente, e apresentaram pH e temperatura ótimos próximos a 4,0 e 60 °C. A α-Ara1 foi identificada como membro da família GH51 e a αAra2 como uma GH54. Se comparada à α-Ara1, α-Ara2 apresentou maior atividade específica em diferentes substratos, além de maiores eficiências catalíticas ao atuar sobre substratos naturais e complexos, provavelmente devido à presença do domínio de ligação à carboidrato CBM42, presente na estrutura desse enzima. A suplementação do coquetel comercial Multifect® CL com a α-Ara2 aumentou 1,6 vezes e liberação de glicose e 3,6 vezes a produção de xilose. Resultado idêntico foi observado após a combinação do coquetel comercial com as duas α-arabinofuranosidases purificadas, o que indicou sinergismo entre as mesmas. Portanto, o presente estudo contribui para maior conhecimento dos efeitos de diferentes pré-tratamentos na atuação das enzimas produzidas por C. cubensis, bem como traz algumas inovações relacionadas ao processo de produção de enzimas desse fungo e ao estudo de novas α-arabinofuranosidases com potencial para aplicação na indústria de etanol lignocelulósico.
Serratia marcescens resistente ao manganês e estratégias para biorremediação de ambientes contaminados.
(2018) Queiroz, Pollyana Santos; Cota, Renata Guerra de Sá; Góes Neto, Aristóteles; Cota, Renata Guerra de Sá; Babá, Élio Hideo; Andrade, Milton Hércules Guerra de
O manganês (II) solúvel que tem sido associado a uma crescente contaminação de corpos aquáticos e problemas de saúde humana devido à sua toxicidade. Na busca por estratégias ecologicamente adequadas para a sua remoção, podemos destacar os isolados de Serratia marcescens, que teve seu o potencial demonstrado na remoção de altas concentrações desse metal. Como forma de melhorar a eficiência de remoção de Mn (II) dessa espécie, um meio de cultura rico em nutrientes (meio NB) suplementado com Mn (II) foi comparado com um meio pobre em nutrientes (meio K) para avaliar a sua influência no processo de remoção por duas diferentes cepas, uma não pigmentada (CL11) e outra pigmentada (LG1) que ainda não tinha sido estudada. Uma vez que um meio rico pode favorecer um maior crescimento bacteriano, uma maior remoção de Mn (II) pode ocorrer. No meio NB, a cepa LG1 e a cepa CL11 exibiram um melhor crescimento e maior tolerância ao Mn (II) (0-2000 mg L − 1). Além disso, uma melhor remoção de Mn (II) (64,25%) e o aumento da formação de óxidos de Mn foram observados neste meio, especialmente para o isolado LG1. A análise de EELS revelou Mn no interior da célula de LG1 e a análise de EDX revelou Mn fora da célula de CL11, indicando que as duas cepas removem Mn (II) através de mecanismos distintos. A bioxidação de Mn pelo isolado CL11 parece envolver mecanismos indiretos que alteram o pH do meio, enquanto o isolado LG1 parece usar um mecanismo direto para a biooxidação mediada por componentes celulares, como proteínas intracelulares. É a primeira vez que o alto potencial do meio NB para remoção de Mn é demonstrado. Este meio influenciou em uma melhor remoção de Mn e na formação de óxidos, especialmente no caso do isolado LG1 pigmentado. Como a cepa LG1 apresentou um potencial diferenciado na bio-oxidação de Mn (II), o seu foi proteoma foi analisado na ausência e presença de Mn (II) através da abordagem shotgun, para obter informações sobre como as bactérias respondem a esse metal e identificar as proteínas envolvidas na sua oxidação. A cepa LG1, que cresceu igualmente bem nas duas condições, expressou um conjunto de proteínas relacionadas aos processos celulares vitais para a sobrevivência, bem como proteínas envolvidas na adaptação e tolerância ao Mn (II). A multicobre oxidase CueO foi identificada, indicando sua provável participação na bioxidação de Mn (II), no entanto, sua expressão não foi modulada pela presença desse metal. Um conjunto de proteínas relacionadas aos processos celulares e metabólicos vitais para as células foram reguladas negativamente na presença de Mn (II), enquanto as proteínas relacionadas à membrana celular envolvidas na manutenção da integridade celular e sobrevivência sob estresse foram upreguladas sob essa condição. Este estudo permitiu obter o primeiro proteoma total dessa espécie nas condições de ausência de presença de Mn (II). O pigmento prodigiosina sintetizado pela cepa LG1 foi caracterizado e foi possível observar o efeito de elevadas concentrações de Mn (II) na sua produção e o seu efeito protetor para a cepa nessas condições. Entretanto é necessário estudar a relação direta da prodigiosina com a remoção de Mn (II). Em conjuntos, estes resultados demonstram o potencial biotecnológico de isolados de S. marcescens na biorremediação de Mn (II) e sugerimos a sua utilização juntamente com o meio NB em grandes biorreatores contínuos para o tratamento de efluentes contaminados com Mn. Além disso, a lista de proteínas expressas identificadas pela análise proteômica pode ser usada como uma ferramenta em experimentos futuros para validar esses achados.
Análise poligênica da tolerância ao alumínio em Saccharomyces cerevisiae por mapeamento de QTL.
(2018) Mezadri, Hygor; Brandão, Rogélio Lopes; Thevelein, Johan; Dumortier, Françoise; Brandão, Rogélio Lopes; Rosa, Carlos Augusto; Tótola, Marcos Rogério; Cota, Renata Guerra de Sá; Freitas, Renata Nascimento de
O bioetanol é um produto de grande importância econômica, principalmente devido a sua utilização como combustível renovável. A levedura Saccharomyces cerevisiae utiliza a sacarose obtida da cana-de-açúcar para produzir bioetanol por fermentação. Alguns fatores diminuem a capacidade fermentativa dessa levedura, por exemplo, a presença de Al3+ no caldo de cana-de-açúcar, levando a um aumento do tempo de fermentação e menor produção de bioetanol. Este trabalho teve como objetivo realizar a análise poligênica da tolerância ao alumínio em Saccharomyces cerevisiae utilizando a técnica de mapeamento de QTLs (Quantitative Trait Locus). Uma triagem entre 840 estirpes de leveduras isoladas de diferentes ambientes foi feita a fim de selecionar uma altamente tolerante ao alumínio. Dentre as estirpes testadas, a levedura denominada Bruggeman Fresh apresentou crescimento e melhor desempenho fermentativo em presença de 5 mM de Al2(SO4)3. A estirpe PE-2, amplamente utilizada na produção de etanol pela indústria brasileira, apresentou uma maior sensibilidade ao alumínio. Estas duas leveduras, Bruggeman Fresh e PE-2, foram escolhidas para a estratégia de análise poligênica para o fenótipo de resistência ao alumínio adotada neste estudo. Após esporulação e dissecação das tétrades, os parentais superior e inferior foram selecionados e cruzados dando origem ao híbrido diploide. Foi realizado um pré-teste em meio sólido contendo alumínio com 658 segregantes obtidos a partir desse híbrido diploide, sendo que 150 segregantes foram selecionados e submetidos ao teste fermentativo. A partir do teste da performance fermentativa em presença de Al2(SO4)3, 30 segregantes foram selecionados como fenótipo superior (alta tolerância ao alumínio). Foi realizada a extração do DNA genômico desses 30 segregantes agrupados e 120 segregantes não selecionados (agrupados randomicamente), assim como das estirpes parentais superior e inferior e sequenciadas. A partir das análises das sequências e mapeamento de QTL foi encontrada uma região no cromossomo VI com grande ligação ao fenótipo de interesse, observado devido à diferença na frequência dos SNPs entre os grupos selecionado e não selecionado. Após a análise de reciprocidade hemizigótica, foi identificado que o gene FAB1 tem um importante papel sobre a tolerância ao alumínio em S. cerevisiae.
Proteômica quantitativa baseada em espectrometria de massas para estudo do trato alimentar de Schistosoma mansoni com ênfase na glândula esofagiana e suas secreções.
(2018) Neves, Leandro Xavier; Borges, William de Castro; Wilson, R. Alan; Borges, William de Castro; Palmisano, Giuseppe; Castro, Ieso de Miranda; Cota, Renata Guerra de Sá; Marco, Ricardo de
A esquistossomose é uma doença tropical negligenciada que afeta mais de 240 milhões de pessoas em 78 países. Apesar dos esforços para erradicação da doença, fatores como baixa cobertura dos programas de tratamento quimioterápico, métodos diagnóstico pouco sensíveis e reinfecções em regiões endêmicas, constituem desafios para o controle da transmissão. O desenvolvimento de vacinas contra schistosomas constitui uma ferramenta alternativa de combate à doença, porém, a identificação de antígenos protetores tem sido um grande desafio. Neste sentido, destaca-se o modelo de auto cura da infecção em macaco Rhesus (Macaca mulatta), no qual observa-se eliminação de parasitos após uma resposta humoral direcionada às interfaces do parasito, como tegumento e secreções da glândula esofagiana. Neste contexto, o presente trabalho teve como objetivo geral a caracterização proteômica em larga escala de produtos da glândula esofagiana e demais secreções do trato alimentar de S. mansoni para proposição de novos alvos vacinais. Uma abordagem quantitativa avaliou a presença de proteínas de interface em homogenato solúvel de vermes adultos, revelando uma baixa representatividade de moléculas de interesse nessa fração. A partir disso, um método de enriquecimento tecidual foi utilizado para a análise detalhada do esôfago de vermes machos adultos. As análises shotgun quantitativas apontaram 628 grupos de proteínas enriquecidos na região esofagiana, incluindo Microexon genes (MEG), hidrolases, glicosil transferases e proteínas para transporte vesicular. Ademais, essa abordagem permitiu a detecção de proteoformas de MEGs geradas por substituição e/ou deleção de resíduos de aminoácidos. Nove proteínas expressas na glândula esofagiana foram selecionadas para quantificação absoluta por QconCAT. A MEG-12 apresentou a maior concentração entre os alvos quantificados. A estimativa do número de cópias por célula das proteínas secretadas sugere que tais moléculas constituem alvos abundantes neste subproteoma. Por último, a caracterização proteômica do sobrenadante de cultura de S. mansoni resultou na detecção de um repertório expandido de proteínas do trato alimentar, incluindo MEGs esofagianas, reforçando a eventual exposição das secreções nessa interface parasito-hospedeiro. Em conjunto, as abordagens proteômicas de caracterização da região esofagiana e trato alimentar de S. mansoni resultaram na identificação de moléculas com potencial aplicação biotecnológica no desenvolvimento de vacinas, bem como alvos terapêuticos.
Detoxificação e aproveitamento da fração líquida proveniente do prétratamento do bagaço de cana-de-açúcar visando produção de xilitol.
(2018) Passarinho, Amanda Tafuri Paniago; Guimarães, Valéria Monteze; Guimarães, Valéria Monteze; Gonçalves, Daniel Bonoto; Porto, Lia de Mendonça; Viana, Pollyanna Amaral; Brandão, Rogélio Lopes
Uma biorrefinaria de cana-de-açúcar é definida como um processo industrial capaz de produzir diferentes produtos e subprodutos a partir da mesma matéria-prima. Este sistema geralmente trabalha com o processamento de uma biomassa para a produção de um combustível, um produto químico ou energia/calor. O Brasil é o maior produtor mundial de cana-de-açúcar, que é a maior cultura cultivada globalmente, sendo que o resíduo gerado após a extração do suco é uma boa fonte de biomassa que pode ser usada em diversos processos dentro da indústria. A biomassa lignocelulósica apresenta um enorme potencial para produção de biocombustíveis devido à sua grande disponibilidade e baixo custo. Entretanto, para que o etanol lignocelulósico seja competitivo e economicamente viável é necessário integrá-lo à produção de outros compostos. Poliol com elevado poder edulcorante, semelhante à sacarose, o xilitol é tolerado por diabéticos e tem várias aplicações. Sua produção química pode ser substituída pela produção biotecnológica, a qual teve sua viabilidade demonstrada por diversos trabalhos, sendo bastante eficiente quando integrada a produção de etanol de segunda geração. A etapa inicial para obtenção destes produtos é o pré-tratamento, que altera a estrutura da biomassa e facilita o acesso das enzimas para liberar açúcares fermentescíveis. Quando se utiliza ácido diluído, este processo permite moderada liberação de glicose e xilose. Assim, trabalhando em um processo integrado, a glicose liberada pode ser fermentada a etanol, enquanto a xilose é direcionada para produção de xilitol. Uma outra alternativa seria a utilização de um micro-organismo que consiga fermentar pentose a etanol. Entretanto, como desvantagem, há a formação de inibidores da fermentação microbiana, o que demanda a necessidade de uma etapa adicional de detoxificação. O objetivo deste trabalho é propor uma estratégia de detoxificação que permita aumentar a produção de açúcares e produtos de valor agregado no processo de etanol 2G. Inicialmente, foram testadas diferentes concentrações de ácido sulfúrico (0,5, 2 e 4% v/v) para o pré-tratamento do bagaço de cana (10% p/v) a 120 °C por 1 hora e foram avaliados a eficiência da liberação de glicose e xilose e a formação de compostos tóxicos. Foi observada maior liberação de açúcares a partir do tratamento com 2% de ácido em relação àquele utilizando 0,5%, no entanto não foi observada diferença expressiva para o tratamento com 4% de ácido em relação a 2%. A formação de inibidores foi proporcional à concentração de ácido. Desta forma, foi selecionada a concentração de 2% de H2SO4 e foram testadas a concentração de biomassa (5, 10, 15 e 20%) e tempo de prétratamento (30 e 60 min). Maiores concentrações, tanto dos açúcares quanto dos inibidores, foram observadas no tratamento com 20% de biomassa e tempo de 60 min. Os ácidos alifáticos (acético e fórmico) e os furanos (furfural e hidroximetil-furfural) foram detectados em todos os tratamentos com 60 min e apenas no tratamento usando a maior concentração de biomassa (20%) durante 30 min. Os fenólicos foram também detectados em todos os tratamentos. Assim, a melhor condição para o pré-tratamento foi selecionada como sendo aquela que utilizou 15 % de bagaço, por 30 min, e que forneceu 5,32 g.L-1 de glicose, 27,7 g.L-1 de xilose e apenas compostos fenólicos (1,70 g.L-1) como inibidores. Na detoxificação, o tratamento com carvão ativado não removeu uma parcela significativa dos fenólicos, enquanto o tratamento com a lacase presente no extrato bruto de Chrysoporthe cubensis proporcionou a oxidação de 80% destes compostos, com aumento de 20% de glicose e xilose. A partir deste resultado, fez-se um delineamento composto central rotacional com os fatores concentração de fenólicos e carga de lacase presente no extrato bruto de Chrysoporthe cubensis para detoxificação. A validação exibiu valores satisfatórios para os parâmetros bias e acurácia, o que indica um bom ajuste das superfícies geradas e o escalonamento permitiu conhecer o comportamento da enzima para oxidação do seu substrato em volumes maiores. Para a sacarificação direta com Cellic CTec 2, a redução de 14% nos inibidores pela lacase permitiu um aumento de 30% na produção de xilose, visto que hemicelulases são mais susceptíveis a ação destes compostos. Esta etapa de detoxificação precedeu a fermentação da fração líquida por Debaryomyces hansenii UFV-1 em que a redução de 7% no conteúdo fenólico promoveu um aumento de 21 vezes na produção de xilitol.
Bioprospecção bacteriana para produção de bio-hidrogênio a partir de hidrolisado hemicelulósico e avaliação do processo fermentativo.
(2018) Rincon, Ivon Maritza Campos; Silva, Silvana de Queiroz; Silva, Silvana de Queiroz; Oliveira Júnior, Ênio Nazaré de; Moreira, Leandro Marcio; Pantoja, Lílian de Araújo; Guimarães, Valeria Monteze
A substituição das energias baseadas no petróleo por outras fontes energéticas mais ambientalmente amigáveis é uma ideia que ganha mais força a cada dia. Os resíduos da atividade agrícola e florestal são considerados matéria-prima renovável, de baixo custo e abundante, principalmente, considerando que o Brasil é um grande produtor de cana-deaçúcar. No contexto da biorrefinaria, a partir dos resíduos desta atividade agrícola podem ser produzidos vários biocombustíveis implicando no uso eficaz dos recursos e dos produtos gerados. Desse modo, este trabalho buscou isolar e selecionar linhagens bacterianas capazes de produzir bio-hidrogênio a partir da fermentação de açúcares hemicelulósicos. O processo fermentativo foi investigado utilizando substratos sintéticos e um hidrolisado lignocelulósico real. Dentre vários isolados, duas culturas se destacaram quanto à utilização dos açúcares, Enterobacter sp (isolado 2) e Raoultella sp (isolado 11). As melhores conversões na produção de bio-hidrogênio foram obtidas a partir da fermentação de 11 g/L de xilose com valores de 1,17 e 1,74 mmol H2/mmol substrato, respectivamente para Raoultella sp e Enterobacter sp, tendo o ácido acético como principal subproduto desta fermentação. Os valores das conversões diminuíram para 0,4 e 0,3 mmol H2/mmol substrato, para o isolado 2 e 11 respectivamente, quando utilizado o hidrolisado hemicelulósico real diluído. Para investigar a toxicidade do hidrolisado, inibidores foram adicionados na fermentação e para ambos os isolados, a adição de ácido acético afetou negativamente a conversão e a produção de H2. Dois métodos de destoxificação do hidrolisado lignocelulósico foram testados, os resultados mostraram que o uso de carvão ativado no ensaio de fermentação promoveu um aumento de 2x na produção de H2 (0,31mmol) para o isolado 2. Levando-se em consideração todos os resultados as linhagens Enterobacter sp 2 e e Raoultella sp 11 apresentam potencial de aplicação em processos fermentativos no contexto da biorrefinaria.
Avaliação da fermentação de glicerol por Enterobacter sp. para a produção de hidrogênio e etanol.
(2019) Zorel, José Augusto; Silva, Silvana de Queiroz; Santos, Alexandre Soares dos; Baeta, Bruno Eduardo Lobo; Moreira, Leandro Marcio; Coelho, Maria Alice Zarur; Silva, Silvana de Queiroz
A despeito da imagem de sustentabilidade que acompanha o biodiesel, o balanço de massa de seu ciclo de vida ainda está longe de ser fechado, de modo que, com a expansão do biodiesel e em dependência de fatores do mercado, o glicerol pode ser considerado como coproduto ou resíduo. Portanto, a expansão sustentável das indústrias de biodiesel depende do tratamento do glicerol. Nesse sentido, a fermentação escura pode aliar o tratamento do glicerol à produção de monômeros, energia e biocombustíveis (como H2 e etanol), aumentando a gama de produtos das indústrias de biodiesel. No entanto, esse processo ainda é dificultado pela presença de impurezas e pelas altas concentrações necessárias para conferir aplicabilidade ao processo. Desse modo, esse trabalho avaliou as alterações no metabolismo fermentativo de dois isolados de Enterobacter sp., 3R e 9R, em resposta a variadas concentrações iniciais de glicerol (5, 10 e 40 gL-1; G5, G10 e G40, respectivamente). Apresentando-se como mais promissor, o isolado 9R foi avaliado quanto aos efeitos de impurezas, pH, oxigenação e quantidade de células sobre a bioconversão do glicerol. Os resultados desses testes serviram como base para definir os fatores pH, quantidade de células e concentração de glicerol como os mais influentes sobre o desempenho do isolado. Em seguida, foi realizada a busca dos melhores valores para esses parâmetros com uso da matriz de Doehlert e da função de desejabilidade. Desse modo, foram definidas três configurações visando diferentes objetivos: HEPG (maior consumo de glicerol e produção simultânea de H2, etanol e 1,3-PDO; sendo os valores ótimos: pH 7,85; 27,5 GI; 0,009 Inóc.); PG (maior consumo de glicerol e produção de 1,3-PDO; sendo os valores ótimos: pH 7,70; 41,0 GI; 0,009 Inóc.); e HEG (maior consumo de glicerol e produção simultânea de H2 e etanol; sendo os valores ótimos: pH 8,00; 23,0 GI; 0,009 Inóc.). Os resultados dos ensaios determinados pela função de desejabilidade ficaram de acordo com o estipulado, sendo obtidos os valores máximos de 59,4 mmol L-1 para a produção de H2 e 7,6 gL-1 (164,28 mmolL-1) para a produção de etanol pela configuração HEG. O consumo de glicerol também foi otimizado, alcançando na condição HEG o valor de 22,5 gL-1 (98,0 % do glicerol adicionado) em menos 24 horas. Essa condição possibilitou a obtenção de 0,42 L de etanol e 59,04 L H2 por kg de glicerol consumido. Espera-se que os resultados obtidos nesse trabalho sirvam como base para os próximos estudos desenvolvidos por nosso grupo no campo de bioconversão do glicerol.
Desenvolvimento de carreadores lipídicos constituídos por lípides da flora amazônica com propriedade antioxidante contendo fragrâncias naturais para melhora do odor corpóreo relativo ao envelhecimento cutâneo.
(2019) Kaufmann, Giana Thais; Santos, Orlando David Henrique dos; Goulart, Gisele Assis Castro; Santos, Orlando David Henrique dos; Goulart, Gisele Assis Castro; Silva, Elton Luiz; Carneiro, Guilherme; Souza, Gustavo Henrique Bianco de; Vieira Filho, Sidney Augusto
Com o envelhecimento cronológico há uma redução dos sistemas intrínsecos antioxidantes da pele, resultando em danos cutâneos e geração de compostos responsáveis pelo odor característico da idade. No intuito de minimizar esses danos, propomos o desenvolvimento de nanopartículas lipídicas (nanopartículas lipídica sólidas- NLS e carreadores lipídicos nanoestruturados – CLN) constituídos de manteigas e óleos extravirgens provenientes da flora amazônica contendo fragrâncias naturais com habilidade de mascarar e harmonizar o odor relativo ao envelhecimento. Para composição da matriz lipídica das nanopartículas, as manteigas de ucuúba e de muru-muru e os óleos de patauá e de castanha-do-Brasil foram avaliados quanto às suas características físico-químicas, composição da fração insaponificável e em ácidos graxos e atividade antioxidante pelos métodos de DPPH, ABTS e proteção do ácido palmitoleico (AP) frente ao esqualeno hidroperóxido (EHP). A manteiga de ucuúba apresentou a maior concentração de fitosteróis (287 mg EC/100g), de compostos fenólicos totais (775 mg EAG/100g) e maiores índices de atividade antioxidante: EC50 de 0,83 mg/mL e 18,74 g ET/kg (DPPH) e 18,87 g ET/kg (ABTS). Com exceção da manteiga de muru-muru, todos os materiais demonstraram atividade antioxidante similar ao BHT frente ao EHP. Foram desenvolvidas 7 fragrâncias com óleos essenciais para cada gênero e avaliadas quanto a capacidade de mascarar e/ou harmonizar o odor relativo a idade e quanto à atividade antioxidante. Todas demonstraram capacidade de mascarar o odor do 2-nonenal sem diferenças significativas (p>0,05), porém as fragrâncias F4 e M4 potencializaram a harmonização do odor deste aldeído, sendo selecionadas. Na otimização da produção das NLS e CLN, com ou sem adição de F4 e M4, foram avaliados 7 tensoativos polihidroxilados, duas técnicas de produção (homogeneização a quente com sonda de ultrassom de alta potência - US e homogeneização por alta pressão - HAP) e duas condições de resfriamento (banho de gelo - BG e temperatura ambiente - TA). Todas as formulações foram avaliadas quanto a eficiência de encapsulação (EE) e recuperação do processo (RP) por CG-EM, tamanho de partículas, índice de polidispersão (PDI), potencial zeta (PZ) e pH em dois tempos: T0 (48 horas após a produção) e T65 (65 dias após a produção). As nanopartículas também foram avaliadas por fracionamento de fluxo assimétrico (AF4), por microscopia eletrônica de transmissão e atividade antioxidante frente ao EHP. Dentre as formulações avaliadas e condições de processo, os CLN-M4 BG apresentaram os melhores resultados: EET0 de 88,8%, EET65 de 63,7% e RP de 92,2. As formulações com F4 produzidas por HAP apresentaram EET0 de 97,5%, EET65 de 73,1% e RP de 32,8%. Todas as formulações produzidas apresentaram tamanho médio inferiores de 170 nm, distribuição monodispersa (≤ 0,3) e PZ acima de 30 mv. Adicionalmente, também apresentaram atividade antioxidante contra o EHP similar ao BHT, o que as torna promissoras como agentes antioxidantes para minimização dos processos oxidativos cutâneos e como sistema preventivo na formação do odor relativo a idade.
Estudos sobre consumo de glicerol por leveduras para fins biotecnológicos.
(2019) Cunha, Aureliano Claret da; Brandão, Rogélio Lopes; Santos, Fernanda Godoy; Lucas, Cândida Manuel Ribeiro Simões; Brandão, Rogélio Lopes; Tótola, Marcos Rogério; Freitas, Renata Nascimento de; Silva, Silvana de Queiroz; Mendes, Tiago Antônio de Oliveira
Nos últimos anos o aumento do excedente de produção do glicerol bruto, um subproduto da produção do biodiesel, tem estimulado a busca por processos alternativos de aplicação do glicerol. De entre as alternativas, destacam-se os processos biotecnológicos onde o glicerol é convertido por microrganismos em um produto com maior valor agregado, de amplo uso industrial e com menor impacto ambiental. O objetivo do presente trabalho foi caracterizar Wickerhamomyces anomalus LBCM1105, uma cepa capaz de utilizar eficientemente o glicerol como única fonte de carbono, através do isolamento e caracterização do transportador de alta afinidade de glicerol (WaStl1p), e do sequenciamento do seu genoma. Estratégias de engenharia genética foram também utilizadas em Saccharomyces cerevisiae BY4741, com intuito de otimizar o consumo de glicerol e obter a sua conversão em etanol. LBCM1105 apresentou velocidades de crescimento maiores que BY4741 independente do meio (YP ou YNB) e da fonte de carbono (glicose ou glicerol). Com o objetivo de melhorar o desempenho de BY4741 em glicerol, foi tentada a sobrexpressão simultânea do transportador ativo de glicerol Stl1 e da primeira enzima da assimilação do glicerol, a glicerol quinase Gut1, com vista a aumentar o fluxo metabólico de consumo do glicerol. Adicionalmente foi também sobrexpresso o fator de transcrição/ativador Pdc2 que controla vários genes, incluindo PDC1, PDC10 e THI10, com vista a promover o desvio do fluxo glicolítico para a fermentação. Todas as construções foram confirmadas por amplificação de fragmentos alvo e sequenciamento de DNA. O desempenho final de cada mutante foi avaliado, não tendo sido obtido o efeito esperado. A taxa de crescimento foi tanto menor quanto mais modificações genéticas, sugerindo uma diminuição de fitness proporcional. Em colaboração com o Laboratório Nacional de Ciência e Tecnologia do Bioetanol (CTBE), o genoma da LBCM1105 foi sequenciado, montado, anotado e submetido a análises filogenéticas multiloci. O genoma da W. anomalus LBCM1105 apresenta 12,78 Mb, com %CG de 34,52, cobertura de 20,5x em profundidade e 90% de extensão e completude. Comparando com leveduras conhecidas, o genoma contém todas as sequências de proteínas relacionadas ao transporte e metabolismo de glicerol. O gene WaSTL1 foi isolado por PCR e clonado no vetor (pCev-G2-Km). O mutante S. cerevisiae BY4741 stl1Δ foi transformado com a construção. A caracterização do mecanismo de transporte de glicerol confirmou (i) que WaStl1p tem uma elevada afinidade para o glicerol, Km = 0,96 ± 0,15 mM, (ii) que a cepa LBCM1105 apresenta além da afinidade uma elevada quantidade de transportador ativo, Vmax = 148,3 ± 10,16 μmol·h−1·g−1, e (iii) que o gene expresso heterologamente em S. cerevisiae stl1Δ complementa o mutante. O caráter ativo do transporte foi confirmado pela sensibilidade ao protonionóforo carbonil cianeto m-clorofenilhidrazona, tanto na LBCM1105 como na S. cerevisiae stl1Δ WaSTL1. Futuros estudos das vias metabólicas de glicerol em leveduras serão necessários para que novas estratégias de engenharia genética sejam mais eficientes.
Desenvolvimento de biossensor para detecção direta de Flavivirus utilizando nanobastões de ouro.
(2019) Ribeiro, Erica Milena de Castro; Silva, Breno de Mello; Silva, Breno de Mello; Tótola, Antônio Helvécio; Figueiredo, Rute Cunha; Paula, Sérgio Oliveira de; Mosqueira, Vanessa Carla Furtado
A co-circulação de Dengue virus, Zika virus, Yellow fever virus, Chikungunia virus e Mayaro virus tem causado grande impacto na saúde pública brasileira e mundial. Os programas de controle e prevenção de arboviroses e estudos epidemiológicos poderiam ser muito beneficiados e aperfeiçoados com a utilização de metodologias de detecção direta dos vírus em mosquitos, pois possibilitaria uma vigilância mais precisa nas populações de vetores ao longo do tempo. Porém, os métodos de diagnósticos hoje disponíveis, apesar de possuírem alta sensibilidade e especificidade são, em sua maioria, onerosos, demandam treinamento específico para aplicação e interpretação e não provem um diagnóstico rápido. Neste contexto, o desenvolvimento de novas tecnologias de biossensores que apresentem benefícios quanto ao tempo de análise, sensibilidade e simplicidade de manipulação têm sido objeto de pesquisa nas esferas pública e privada. A partir deste fato, este trabalho propõe desenvolver e analisar a eficácia de metodologias de funcionalização de nanobastões de ouro (NBs) com anticorpos específicos anti-DENV2 e anti-flavivirus para testar a capacidade de detecção de ligação anticorpo-partícula viral. A detecção de biomoléculas ligadas às nanopartículas de ouro (AuNPs), tais como proteínas e anticorpos, pode ser feita a partir da análise do seu espectro de absorção. Para isso, nanobastões de ouro foram sintetizados, funcionalizados a 4 mM de polietilenoimina, conjugados a 0,4 μg/mL de anticorpos e incubados com 103 UFP/mL de vírus. Os dados foram obtidos através da leitura da ressonância plasmônica de superfície localizada em espectrômetro de varredura UV-Vis. A síntese dos nanobastões, que utilizou o método de crescimento com sementes com a utilização de diferentes agentes redutores, mostrou-se reprodutível. Além disso, um deslocamento muito expressivo no pico de absorção foi observado quando biossensores contendo anti-flavivirus foram incubados em solução com DENV2 e ZIKV, mas não foi observado após incubação com MAYV, um Alphavirus utilizado como controle negativo. Como esperado, nos biossensores contendo anti-DENV2 o deslocamento foi observado apenas na presença de DENV2, demonstrando a especificidade dos anticorpos utilizados. Na presença de soro humano diluído 1:3200 e macerado de mosquito diluído 8x, contendo DENV2 ou ZIKV, o limite de detecção estimado foi de 100 UFP/mL. Assim, sugere-se que os nanobastões de ouro apresentam potencial para o desenvolvimento de novas metodologias de diagnóstico mais rápidos, precisos e práticos que as técnicas já existentes e viabilizar estudos de vigilância da virologia em mosquitos.
Avaliação in silico e in vitro do efeito tripanocida de óleos essenciais e desenvolvimento de sistemas nanoestruturados como alternativa terapêutica da doença de Chagas.
(2019) Seibert, Janaína Brandão; Santos, Orlando David Henrique dos; Vieira, Paula Melo de Abreu; Alexander, Cameron; Santos, Orlando David Henrique dos; Vieira, Paula Melo de Abreu; Silva, André Talvani Pedrosa da; Costa, Daniela Caldeira; Coelho, Eduardo Antônio Ferraz; Santos, Silvana Maria Elói
A falta de uma terapêutica tripanocida eficiente, principalmente na fase crônica da doença de Chagas e sem a presença de efeitos adversos intensos impulsiona a pesquisa para o desenvolvimento de novos fármacos. As substâncias produzidas através do metabolismo secundário de plantas podem apresentar diferentes efeitos biológicos e serem utilizadas como princípios ativos no tratamento de doenças. Dessa forma, o objetivo desse trabalho foi caracterizar quimicamente os óleos essenciais extraídos das espécies Cymbopogon densiflorus, Cymbopogon nardus, Melaleuca leucadendron e Microlicia graveolens, bem como avaliar a atividade anti-Trypanosoma cruzi dos fármacos livres e após encapsulamento em sistemas nanoestruturados. A obtenção desses óleos ocorreu a partir da hidrodestilação das partes aéreas, com rendimentos em torno de 0,1 a 2,0% de acordo com a espécie. A caracterização realizada através da cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas permitiu a identificação de mais de 90% dos compostos, com presença majoritária de monoterpenos oxigenados. A partir da análise in silico foi possível prever inicialmente que todos os óleos em estudo apresentariam potencial contra o parasito T. cruzi. No entanto, na avaliação in vitro desta atividade utilizando a cepa Tulahuen, somente o óleo de folhas de C. densiflorus se revelou ativo, a partir de uma CI50 sobre o parasito equivalente a 60 μg/mL (IS= 3,8). No ensaio de permeabilidade de membrana do parasito, concentrações superiores a 30 μg/mL de óleo apresentaram diferenças em relação ao controle. Este resultado foi confirmado através da microscopia eletrônica de transmissão. Além disso, sistemas nanoemulsionados, lipossomais e micelares carregados de óleo essencial e/ou benznidazol foram desenvolvidos e apresentaram tamanho em escala nanométrica (<500 nm). A adição dos princípios ativos favoreceu a homogeneidade de distribuição de tamanho para todas as formulações. Além disso, potencial zeta negativo e um pH ácido também definiram as formulações. A estabilidade dos sistemas foi avaliada e apenas os lipossomas contendo ambos os fármacos foram instáveis. As formulações foram capazes de reproduzir a atividade tripanocida apresentada pelo óleo e benznidazol a partir de concentrações inferiores quando comparadas aos fármacos livres. No entanto, as micelas foram caracterizadas pelos maiores índices de seletividade e um efeito sinérgico foi comprovado quando ambos os fármacos foram encapsulados concomitantemente nessa forma farmacêutica. Sendo assim, os resultados desse trabalho demonstram o óleo essencial de folhas de C. densiflorus como candidato potencial ao tratamento da doença de Chagas, o qual é capaz de eliminar o T. cruzi in vitro a partir de baixas concentrações. Em adição, as formas micelares contendo benznidazol podem ser uma alternativa na quimioterapêutica chagásica tanto na sua forma simples, bem como, em combinação com o óleo essencial de C. densiflorus.
Parâmetros epigenéticos e parasitológicos associados à esquistossomose mansônica em camundongos C57BL/6 EBi3-/-.
(2020) Mota, Ester Alves; Cota, Renata Guerra de Sá; Cota, Renata Guerra de Sá; Babá, Élio Hideo; Cabral, Fernanda Janku; Andrade, Milton Hércules Guerra de; Soares, Rodrigo Dian de Oliveira Aguiar
A hipótese desse trabalho é que o parasito Schistosoma mansoni em resposta ao sistema imune do hospedeiro mamífero altera seu estado epigenético e modula o estado epigenético do hospedeiro definitivo, e consequentemente a extensão do granuloma hepático. Para investigar essa hipótese foi utilizada a infecção em modelo murino C57BL/6 EBi3-/- e delineados os objetivos específicos: (i) a investigação dos efeitos parasitológicos; (ii) se o parasito modularia mecanismos epigenéticos no hospedeiro; (iii) se o hospedeiro poderia afetar a expressão de genes relacionados a mecanismos epigenéticos do parasito; (iv) avaliar a expressão de miRNAs e lncRNAs de S. mansoni no modelo C57BL/6 EBi3-/- bem como o potencial desses ncRNAs como biomarcadores (v) avaliar a expressão de genes relacionados a epigenética na cepa LE do S. mansoni resistente ao praziquantel (LE-PZQ). Foram utilizados camundongos C57BL/6 WTC (selvagem controle), WTI (selvagem infectado), EBi3-/-C (nocaute controle) e EBi3-/- I ( nocaute infectado) todos com 55 dias de infecção, 100 cercárias. Nos experimentos com S. mansoni, foram utilizados pool de parasitos recuperados de camundongos WT (LE-controle), cepa LE-PZQ e recuperados de EBi3-/- (LE de EBi3-/- ). Os resultados mostram que a esquistossomose murina no modelo C57BL/6 EBi3-/- I apresenta uma diminuição no dano hepático, no volume e número dos granulomas e quantidade de ovos nas fezes em relação ao observado no grupo WTI, (p<0,05) A demetilação do DNA está mais ativa que a metilação em todos os grupos devido ao maior nível de expressão das TETs em comparação com a expressão das DNMTs, sendo que, quanto maior o número de granulomas, menor a expressão de TET3 e DNMT1 em EBi3-/- I (p<0,05) A infecção por S. mansoni induz uma diminuição no conteúdo de metilação global do DNA. Os vermes adultos machos, recuperados do modelo C57BL/6 EBi3-/- apresentaram uma diminuição no conteúdo de metilação global do DNA comparando com o macho controle, bem como diminuição na expressão de SmUSPs 7, 22, 46 e 49, o que pode afetar o turnover da via ubiquitinaproteassoma e alterar o padrão de ubiquitinação nas histonas. Já na cepa LE-PZQ o SmUSP15 foi o único gene up regulado em machos. Verificamos também que os miRNAs 190 e 125A possuem função sexo-específica em S. mansoni, o miR-190-3p foi o único encontrado no plasma de C57BL/6 EBi3-/- I. Os lncRNA5 6 e 7 foram detectados no plasma de C57BL/6 EBi3-/- . Os dados indicam uma modulação epigenética do hospedeiro mamífero no parasito e abrem perspectivas para a influência epigenética na interação parasito-hospedeiro.