PPBIOTEC - Doutorado (Teses)
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Item Avaliação comparativa do processo auto-fermentativo e bioaumentado de diferentes amostras de bagaços de cana- de-açúcar : identificação da microbiota autóctone e produtos gerados.(2023) Souza, Isabela Morato de; Silva, Silvana de Queiroz; Gurgel, Leandro Vinícius Alves; Silva, Silvana de Queiroz; Guimarães, Valéria Monteze; Zorel, José Augusto; Brandão, Rogélio Lopes; Barreto, Elisa da SilvaO bagaço de cana-de-açúcar (BCA) é um material remanescente da indústria sucroalcooleira considerado fonte renovável, de baixo custo e rico em açúcares. A conversão desta biomassa lignocelulósica em bioprodutos é uma alternativa favorável para amenizar problemas ambientais causados pelo uso excessivo de matéria-prima de origem fóssil, além de contribuir para o conceito de biorrefinaria. Entretanto, devido à sua estrutura recalcitrante, o acesso aos açúcares do biomaterial é um desafio para microrganismos fermentadores. Assim sendo, objetivando alcançar um bioprocesso consolidado, o presente estudo investigou o potencial hidrolítico e fermentativo da microbiota autóctone do BCA bruto durante sua fermentação, bem como a prospecção dos microrganismos presentes na biomassa. Nos ensaios de fermentação foram testadas amostras de BCA de seis usinas (A, B, C, D, E e F) na concentração de 10 g/L, monitoradas por 408 h a 37oC, sob agitação. As cepas cultiváveis foram coletadas no tempo 96 h e três delas (X, Y e Z) foram selecionadas para serem inoculadas individualmente em ensaios bioaumentados. A caracterização metagenômica do consórcio microbiano foi realizada e para quantificação dos metabólitos obtidos durante a fermentação foi feita a análise da fração líquida, enquanto a fração sólida foi caracterizada a fim de determinar os teores de celulose, hemiceluloses e lignina no início e ao final do ensaio. A microbiota presente nos bagaços no início da fermentação incluiu principalmente organismos do gênero Acetobacter, ao passo que, com 96 h de ensaio houve predominância de bactérias fermentadoras, como Clostridium, Enterobacter e Ruminiclostridium. Ao final do ensaio a abundância de Ruminiclostridium foi expressiva para as amostras analisadas neste momento. Dentre as condições testadas, alcançou-se a remoção de 37% da fração de lignina, 58% de celulose e 44% de hemiceluloses na fermentação do bagaço D por sua microbiota autóctone bioaumentada por Klebsiella pneumoniae (isolado X). Os principais produtos obtidos foram ácido caproico (2,81 g/L em Dy), etanol (2,68 g/L em A), ácido acético (1,15 g/L em D), ácido isobutírico (0,97 g/L em E), metanol (0,97 g/L em A) e ácido propiônico (0,34 g/L em C). Isto demonstra o elevado potencial lignocelulolítico da microbiota autóctone do BCA por acessar e fermentar o próprio substrato, demonstrando a possibilidade de obtenção de bioprodutos de valor agregado através do bioprocesso consolidado.Item Análise de QTL e gênomica comparativa para estudar mecanismos regulatórios da H+ -ATPASE de membrana plasmática de Saccharomyces cerevisiae.(2021) Barbosa, Patrícia Gonçalves Prates; Brandão, Rogélio Lopes; Cunha, Aureliano Claret da; Cruz, Izinara Rosse da; Brandão, Rogélio Lopes; Fietto, Luciano Gomes; Mendes, Tiago Antônio de Oliveira; Andrade, Milton Hércules Guerra de; Silva, Silvana de QueirozA H+ -ATPase é uma proteína presente na membrana citoplasmática de plantas e fungos e desempenha um papel essencial na geração de um gradiente eletroquímico de prótons, importante para a captação de nutrientes e regulação do pH intracelular. A ativação da H + -ATPase da membrana citoplasmática em Saccharomyces cerevisiae induzida por glicose é supostamente atribuída a um sinal de cálcio intracelular correlacionado ao metabolismo do fosfatidilinositol. Em estudos anteriores do nosso grupo de pesquisa, foi observada diferença de fenótipo entre as cepas S. cerevisiae BY4742 arg82Δ e PJ69 arg82Δ através do teste de atividade da H + -ATPase, indicando que o fenótipo de maior ativação da H + -ATPase está relacionado a vários genes. Diante do exposto, o objetivo deste trabalho foi utilizar diferentes abordagens genômicas para identificar novos componentes da regulação induzida por glicose da H + -ATPase. Para isso, foram realizados o sequenciamento do genoma segregante agrupado, mapeamento de QTLs e análises de Bioinformática para identificar o possível motivo da diferença de fenótipo e, ou, novos componentes desta via de transdução de sinal. Uma vez identificadas as variantes na análise de mapeamento de QTL foi desenvolvido o script SNPsInQTLselection.py para identificar as bases genéticas que podem estar envolvidas com o fenótipo de maior atividade da H+ -ATPase. Após a utilização desse script foram identificadas 42 variantes em 33 genes potencialmente envolvidos com o fenótipo de interesse. Para priorização desses genes candidatos foi realizado análise de enriquecimento e interatoma que permitiram identificar 10 genes enriquecidos e envolvidos na via da telomerase e do fosfatidilinositol (STT4, PIK2, UGA2, EST1, MEC3, HEK2, TOP3, PSO2, STO1, FUR4). Cepas do background BY contendo essesrespectivos genes deletados (coleção EUROSCARF) foram utilizadas para teste de fenótipo de acidificação extracelular e sinalização de cálcio induzida por glicose. Por meio desses testes, 4 (UGA2, FUR4, EST1 e STT4) dos 10 genes enriquecidos, apresentaram o fenótipo de maior ativação da H+ -ATPase, fenótipo esse evidenciado nos testes de acidificação extracelular e sinal de cálcio. Destes 4 genes, vale destacar o STT4 visto que, de acordo com a função descrita para esse gene na literatura o fosfatidilinositol-4-fosfato pode exercer um papel na regulação da via de ativação de H + -ATPase, controlando a atividade da fosfolipase C. Tendo em vista uma relação positiva entre atividade da H + - ATPase e desempenho fermentativo, estudos futuros podem ser feitos com os genes/alelos identificados neste trabalho, com aplicação em cepas de leveduras industriais visando a melhoria na eficiência de processos fermentativos. Os genes (UGA2, FUR4, EST1 e STT4) merecem investigação detalhada para verificação do possível envolvimento na via de sinalização da H+ -ATPase. Esse trabalho apresenta pela primeira vez uma estratégia de Bioinformática para identificar genes candidatos quando o resultado do mapeamento de QTL não for significativo.Item Avaliação in silico e in vitro do efeito tripanocida de óleos essenciais e desenvolvimento de sistemas nanoestruturados como alternativa terapêutica da doença de Chagas.(2019) Seibert, Janaína Brandão; Santos, Orlando David Henrique dos; Vieira, Paula Melo de Abreu; Alexander, Cameron; Santos, Orlando David Henrique dos; Vieira, Paula Melo de Abreu; Silva, André Talvani Pedrosa da; Costa, Daniela Caldeira; Coelho, Eduardo Antônio Ferraz; Santos, Silvana Maria ElóiA falta de uma terapêutica tripanocida eficiente, principalmente na fase crônica da doença de Chagas e sem a presença de efeitos adversos intensos impulsiona a pesquisa para o desenvolvimento de novos fármacos. As substâncias produzidas através do metabolismo secundário de plantas podem apresentar diferentes efeitos biológicos e serem utilizadas como princípios ativos no tratamento de doenças. Dessa forma, o objetivo desse trabalho foi caracterizar quimicamente os óleos essenciais extraídos das espécies Cymbopogon densiflorus, Cymbopogon nardus, Melaleuca leucadendron e Microlicia graveolens, bem como avaliar a atividade anti-Trypanosoma cruzi dos fármacos livres e após encapsulamento em sistemas nanoestruturados. A obtenção desses óleos ocorreu a partir da hidrodestilação das partes aéreas, com rendimentos em torno de 0,1 a 2,0% de acordo com a espécie. A caracterização realizada através da cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas permitiu a identificação de mais de 90% dos compostos, com presença majoritária de monoterpenos oxigenados. A partir da análise in silico foi possível prever inicialmente que todos os óleos em estudo apresentariam potencial contra o parasito T. cruzi. No entanto, na avaliação in vitro desta atividade utilizando a cepa Tulahuen, somente o óleo de folhas de C. densiflorus se revelou ativo, a partir de uma CI50 sobre o parasito equivalente a 60 μg/mL (IS= 3,8). No ensaio de permeabilidade de membrana do parasito, concentrações superiores a 30 μg/mL de óleo apresentaram diferenças em relação ao controle. Este resultado foi confirmado através da microscopia eletrônica de transmissão. Além disso, sistemas nanoemulsionados, lipossomais e micelares carregados de óleo essencial e/ou benznidazol foram desenvolvidos e apresentaram tamanho em escala nanométrica (<500 nm). A adição dos princípios ativos favoreceu a homogeneidade de distribuição de tamanho para todas as formulações. Além disso, potencial zeta negativo e um pH ácido também definiram as formulações. A estabilidade dos sistemas foi avaliada e apenas os lipossomas contendo ambos os fármacos foram instáveis. As formulações foram capazes de reproduzir a atividade tripanocida apresentada pelo óleo e benznidazol a partir de concentrações inferiores quando comparadas aos fármacos livres. No entanto, as micelas foram caracterizadas pelos maiores índices de seletividade e um efeito sinérgico foi comprovado quando ambos os fármacos foram encapsulados concomitantemente nessa forma farmacêutica. Sendo assim, os resultados desse trabalho demonstram o óleo essencial de folhas de C. densiflorus como candidato potencial ao tratamento da doença de Chagas, o qual é capaz de eliminar o T. cruzi in vitro a partir de baixas concentrações. Em adição, as formas micelares contendo benznidazol podem ser uma alternativa na quimioterapêutica chagásica tanto na sua forma simples, bem como, em combinação com o óleo essencial de C. densiflorus.Item Influência da doença de Chagas na farmacocinética do Benznidazol no modelo cão.(2022) Bandeira, Lorena Cera; Carneiro, Cláudia Martins; Pinto, Leonardo Santos Ribeiro; Carneiro, Cláudia Martins; Pinto, Leonardo Santos Ribeiro; Diniz, Andrea; Moreira, Fernanda de Lima; Veloso, Vanja Maria; Jeremias, Wander de JesusA alta variabilidade na eficácia e na segurança da quimioterapia anti-chagásica envolvendo o benznidazol (BNZ) pode ser devido às alterações farmacocinéticas. Tais alterações podem ser ocasionadas pela inibição de enzimas de metabolismo e transportadores de membranas devido ao aumento de mediadores do processo inflamatório na doença de Chagas. O presente estudo avaliou o impacto das infecções experimentais aguda e crônica pela cepa Be-78 do T. cruzi na farmacocinética do BNZ no modelo cão. Foram investigados 19 cães (n= 10 cães com infecção aguda; n= 9 cães com infecção crônica), SRD, com idade entre 04-10 meses e peso entre 20-35 kg. Os cães de ambas as fases da infecção foram divididos em dois grupos, sendo o Grupo I (infectado não tratado) e Grupo II (infectado e tratado). O estudo foi divido em 4 ocasiões. Na Ocasião 1 (antes da infecção) foi realizada coleta de sangue para análise de perfil das citocinas IL-6, IFN-γ, IL-10 e TNF-α por meio de ensaio de ELISA. Na Ocasião 2 (após a infecção, antes do início do tratamento) foi coletado sangue para análise de citocinas e carga parasitária por meio de qPCR. Na Ocasião 3 (após 10, 30, 40 e 60 dias de dose múltipla oral 3,5mg/Kg/12h de BNZ) foi realizada coleta seriada de sangue no intervalo de dose de 12h para análise farmacocinética para o Grupo II; e coleta de sangue para análise de citocinas e carga parasitária para os Grupos I e II. Na Ocasião 4 (após 30 dias do término do tratamento) foi coletado sangue para análise de citocinas e carga parasitária. O BNZ nas amostras de soro foi quantificado por CLAE-DAD. O método bioanalítico validado seguindo o guia da ANVISA, apresentou ausência de efeitos matriz e residual; limites de quantificação, estabilidade, precisão e exatidão compatíveis para a análise do BNZ em soro. Os parâmetros farmacocinéticos do BNZ, obtidos a partir de um modelo não compartimental, foram similares entre os momentos de coleta seriada na Ocasião 3 na fase aguda e também na fase crônica da infecção. O perfil farmacocinético do BNZ obtido em cães na fase aguda da doença é semelhante ao observado em cães sadios (dados históricos do nosso grupo de pesquisa). Por outro lado, foi observado que a infecção crônica aumenta os valores de Cmax (9,70 vs 17,97), Css (7,70 vs 12,56) e AUC0-12 (90,39 vs 150,76), e ainda reduz Vdss (17,34 vs 9,20) e CLss (0,84 vs 0,56) quando comparados com o grupo de cães sadios. Em relação a fase aguda, a fase crônica também eleva os valores de Cmax (10,55 vs 17,97), Css (7,08 vs 12,56), Cmin (4,32 vs 8,25) e AUC0-12 (84,98 vs 150,76) e reduz Vdss (13,92 vs 9,20) e CLss (0,99 vs 0,56). Os mediadores inflamatórios IFN-γ, IL-10, TNF-α e IL-6 estão aumentados nas fases aguda e crônica da doença, sendo a IL-6 a citocina produzida em maior quantidade e a única com aumento significativo (em até 7 vezes) de suas concentrações séricas nos cães da fase crônica em relação à fase aguda, mesmo quando o tratamento com o BNZ é administrado. Nos grupos I e II da fase aguda é observada uma elevada carga parasitária na Ocasião 2 que é reduzida significativamente nas Ocasiões 3 e 4. Nos grupos I e II da fase crônica observa-se uma baixa carga parasitária nas Ocasiões 2 e 3, e um aumento significativo da carga parasitária na Ocasião 4. Portanto, a infecção crônica experimental pela cepa Berenice-78 do T. cruzi altera significativamente a farmacocinética do BNZ em cães, provavelmente pela inibição do transporte de membrana glicoproteína-P (P-gp) causada pelo aumento da citocina pró-inflamatória IL-6.Item Obtenção e estudo de adesivo tópico, radioluminescente e antioxidante para potencial aplicação como dosímetro e radioprotetor no tratamento radioterápico.(2021) Murase, Mariane Satomi Weber; Santos, Orlando David Henrique dos; Santos, Orlando David Henrique dos; Ferreira, Giovana Ribeiro; Silva, Mariana de Melo; Nicolucci, Patrícia; Ruela, Andre Luís MoraisO câncer é uma das principais causas de morbidade e mortalidade no mundo e a radioterapia é um dos tratamentos mais efetivos para a cura, sendo requerido em, pelo menos, 50% dos casos da doença. Porém, seu desempenho pode ser afetado por diversos fatores, de forma que frequentemente são noticiados casos de doses errôneas aplicadas durante o tratamento. Além disso, a utilização não monitorada da radiação pode danificar células saudáveis, como as da pele. Neste contexto, este trabalho traz uma proposta inédita: unir em um filme uma substância capaz de proteger a pele dos danos causados pela radioterapia e um material que apresente mudanças óticas frente a radiação e possa servir como um indicador de dose. Para tanto, foram estudados, por espectroscopia de luminescência e de absorção no UV-Vis, os comportamentos óticos frente à radiação ionizante (Raios x) de dois cintiladores plásticos: 2,5-difeniloxazol (PPO) e 1,4-di(5-fenil-2-oxazolil)benzeno (POPOP), e de um polímero conjugado: poli[2-metóxi,5-(2'etil-hexiloxi)-p-fenilenovinileno] (MEH-PPV). Foram preparados filmes contendo estas substâncias em matrizes de poliestireno (PS) e policloreto de vinila (PVC) e a influência dessas no comportamento ótico dos filmes foi avaliada. Além disso, foi desenvolvido um filme contendo N-acetilcisteína (NAc), um derivado da cisteína que apresenta ação antioxidante e tem grande potencial para tratamento de lesões cutâneas. Possíveis interações entre a substância antioxidante e a matriz polimérica foram avaliados por espectroscopia de absorção na região do infravermelho (espectroscopia IV), já o perfil de liberação da substância ativa foi avaliada por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE). Os espectros dos filmes de PS apresentaram resposta apenas a doses altas. Já os filmes de PVC apresentaram boa resposta ótica a doses baixas e, portanto, se mostraram mais promissores como dosímetro para doses baixas de radiação ionizante. Os resultados da espectroscopia IV mostraram que não houve interação química entre a substância antioxidante e a matriz polimérica e, portanto, foi possível admitir que a NAc manteve suas propriedades. Não obstante, foram preparados filmes com ambas as propriedades: radioluminescentes e antioxidantes. Esses foram preparados com três metodologias distintas e suas propriedades óticas e de liberação também foram analisadas. Os resultados mostraram que a deposição do filme antioxidante sobre o filme radioluminescente apresentou os melhores resultados para a aplicação desejada. O filme obtido se mostrou de grande potencial como dosímetro e radioprotetor para aplicação no tratamento radioterápico, sendo necessária a realização de testes quantitativos e in vivo, em estudos posteriores.Item Diagnóstico de SARS-CoV-2 : uma revisão sistemática e o desenvolvimento de um biossensor com nanobastões de ouro.(2022) Dias, Bruna de Paula; Silva, Breno de Mello; Silva, Breno de Mello; Almeida, Isabela Neves de; Figueiredo, Rute Cunha; Rodrigues, Rodrigo Araújo Lima; Ruiz, Alessandra Cristina GomesDeterminadas infecções virais causam morbidade e mortalidade em todo o mundo e alguns surtos atraíram a atenção nos últimos tempos. No contexto da atual pandemia, a realização do diagnóstico rápido e preciso da COVID-19 é uma estratégia eficaz para o controle da doença, permitindo a triagem e garantindo a intervenção terapêutica oportuna. Frente a isso, diversos testes rápidos e a construção de biossensores foram desenvolvidos nos últimos tempos na busca de uma ferramenta de diagnóstico para serem usadas no ponto de atendimento. Nesse contexto, o presente trabalho analisou relatórios científicos sobre testes rápidos para o diagnóstico de COVID-19 para avaliar seus parâmetros de confiabilidade e propôs desenvolver um biossensor com nanobastões de ouro para detecção de SARS-CoV-2. Para isso, termos ou palavras- chave referentes a testes de diagnóstico rápido e testes de ponto atendimento para SARS-CoV-2 e COVID-19 foram pesquisados em dados publicados de novembro de 2020 a novembro de 2021 nos bancos de dados PubMed e Google Scholar. Para o biossensor, a superfície dos nanobastões foi modificada com polietilenoimina e com anticorpos anti-SARS-CoV-2 (0,25 μg/mL) e testados em seguida contra diferentes concentrações do vírus. Nos relatórios científicos, foram observadas diferenças na sensibilidade entre os testes diretos que usaram amostras distintas, e uma boa acurácia em amostras com valores altos de Ct (RT-PCR). Também se observou falta de sensibilidade nos testes para detecção de anticorpos nos primeiros dias após a infecção, com valores crescentes na análise pós-infecção. Reação cruzada com outros patógenos foi relatada. A maioria dos testes analisados em nosso estudo ainda precisam ser aprimorados para testar a reatividade cruzada contra outros patógenos, principalmente contra outros coronavírus. No que se refere ao biossensor, os nanobastões foram sintetizados pelo método de crescimento com sementes usando hidroquinona como agente redutor e mostrou-se reprodutível e estável por um ano quando armazenado em geladeira. O biossensor proposto foi capaz de diferenciar o vírus alvo do controle apenas em concentrações mais altas do vírus (106 UFP/ml). O uso de Triton X-100 não se mostrou eficaz para melhorar a sensibilidade do biossensor, porém em amostras aquecidas os resultados se mostraram melhores quando comparados a amostras não aquecidas. Novos ensaios deverão ser realizados para o aprimoramento do desenvolvimento de um produto que explore adequadamente as propriedades únicas dos nanobastões de ouro.Item Avaliação in vitro e in vivo da capacidade antioxidante da isobenzofuran-1(3H)-ona no desequilíbrio redox induzido por diquat no cérebro de ratos Wistar.(2022) Ribeiro, Iara Mariana Léllis; Nogueira, Katiane de Oliveira Pinto Coelho; Oliveira, Laser Antônio Machado de; Nogueira, Katiane de Oliveira Pinto Coelho; Menezes, Cristiane Alves da Silva; Oliveira, Jade de; Engel, Daiane FátimaO sistema nervoso é uma rede complexa de células especializadas que transmitem sinais por diferentes partes do corpo para comunicação e controle de funções como emoções, pensamento, comportamento e memória. O alto consumo de oxigênio, níveis antioxidantes relativamente baixos e pouca capacidade regenerativa fazem com que o tecido cerebral seja especialmente suscetível a danos oxidativos e, consequentemente, à neurodegeneração. O diquat (DQ), um herbicida amplamente utilizado na agricultura, é um exemplo de estressor exógeno capaz de sobrecarregar o sistema antioxidante desencadeando danos oxidativos em órgão como o cérebro, fígado e rins. Uma alternativa para a manutenção da homeostase redox diante de agentes estressantes é a utilização de compostos que reparem e substituam biomoléculas oxidadas. Dentro deste contexto, um derivado de isobenzofuran-1(3H)-ona (composto 1) foi avaliado in vitro e in vivo, quanto ao seu poder antioxidante sobre o desequilíbrio redox induzido por DQ. Nos ensaios in vitro, realizados em culturas primárias de neurônios hipocampais, foram avaliados o metabolismo celular, os níveis intracelulares de EROs e os níveis de peroxidação lipídica. Nos estudos in vivo foram realizados, teste bioquímicos, avaliação morfológica do hipocampo e avaliação comportamental de ratos Wistar submetidos ao tratamento com o composto 1 e expostos ao DQ. Os resultados dos testes in vitro mostraram que o tratamento com o composto 1 diminuiu os níveis intracelulares de EROs e a peroxidação lipídica dos neurônios expostos DQ. Nos resultados in vivo, as análises enzimáticas mostraram uma redução significativa da atividade da superóxido dismutase no grupo exposto ao DQ com ou sem tratamento com o composto 1 e um aumento nos níveis da glutationa reduzida no grupo tratado com o composto 1 e exposto ao DQ, o tratamento com o composto 1 também gerou diminuição nos níveis de peroxidação lipídica e proteínas carboniladas no cérebro dos animais expostos ao DQ. A análise morfológica do hipocampo dos ratos expostos ao DQ mostrou aumentos no número neurônios lesionados. O tratamento com o composto 1 reduziu os neurônios lesionados nas regiões CA1 e giro denteado. No teste comportamental observou-se que os animais tratados ou não com o composto 1 e expostos ao DQ apresentaram redução da capacidade locomotora no teste de campo aberto e o tratamento com o composto 1 isoladamente mostrou indicativo de ação ansiolítica. Concluímos, que a exposição ao DQ afeta a homeostase redox, causando danos às células e tecidos analisados, no entanto, esses danos podem ser amenizados pelas propriedades antioxidantes do composto 1.Item Prospecção funcional e potencial biotecnológico de bactérias associadas a anuros do Quadrilátero Ferrífero.(2022) Cordeiro, Isabella Ferreira; Moreira, Leandro Marcio; Moreira, Leandro Marcio; Becker, Carlos Guilherme; Blamires, Daniel; Pires, Maria Rita Silvério; Azevedo, Cristiano Schetini deA contaminação por metais e metaloides tóxicos, natural ou mediada por ação antrópica, tem se tornado um grave problema ambiental, acarretando danos a diversos seres vivos, em especial ao homem. Porém, alguns organismos presentes em distintos níveis tróficos são mais sensíveis a estes contaminantes, e um bom exemplo disso são os anfíbios. Por apresentarem tecido epitelial altamente permeável sofrem mais pela ação destes compostos, o que os colocam, na maioria das vezes, como potenciais bioindicadores de contaminantes. O presente trabalho teve como objetivos prospectar bactérias da pele de anfíbios anuros capazes de tolerar ao arsênio, bem como investigar possíveis relações desta tolerância como mecanismos práticos de aplicação biotecnológica. Para isso, duas investigações paralelas foram conduzidas. Num primeiro momento, isolados bacterianos advindos exclusivamente de anuros de um ambiente contaminado por metais pesados (Estação Ecológica do Tripuí - Ouro Preto, MG) foram avaliados. Para esta abordagem ficou constatado que espécies que possuiam íntimas associações com a água durante seu ciclo reprodutivo apresentam microbiota cultivável mais tolerante e ao mesmo tempo com maior potencial de produção de biofilme, contrapondo-se a microbiota advinda de animais que apresentam menor contato com a água. Considerando que os ambientes aquáticos em áreas contaminadas possuem maior disponibilidade para contato com os organismos vivos, tais resultados são indicativos que tal tolerância e adaptação fisiológica podem contribuir fortemente para a manutenção da sobrevivência da espécie anura quando em contato com estes ambientes no Quadrilátero Ferrífero (QF). Em um segundo momento, a microbiota cultivável associada a cinco espécies da região do QF foi comparada com a microbiota cultivável associada às mesmas espécies, porém advindas de um ambiente não contaminado, localizado a 320 km de distância do primeiro, no Município de João Neiva, ES. Os resultados evidenciaram que a microbiota proveniente das espécies do QF apresentam uma maior tolerância ao arsênio e foram capazes de proteger os anuros da permeabilidade deste metalóide, o que nao foi observado na microbiota advinda das espécies de ambiente não contaminado. Tais dados são indicativos da contribuição desta microbota na manutenção da sobrevivência dos anuros, reiterando os dados apresentados pela primeira abordagem. Como conclusão, os resultados auxiliaram a melhor compreensão desse modelo de interação, bem como classificam potenciais isolados com aplicações biotecnológicas que podem ser melhor exploradas quanto aos possíveis mecanismos moleculares associados a esta notória tolerância.Item Predição metabólica e prospecção de bactérias biocontroladoras e promotoras de crescimento vegetal obtidas em cavernas ferruginosas do Quadrilátero Ferrífero como potenciais inoculantes.(2022) Lemes, Camila Gracyelle de Carvalho; Moreira, Leandro Marcio; Moreira, Leandro Marcio; Santos, Taides Tavares dos; Oliveira, Fábio Soares de; Cruz, Izinara Rosse da; Ribeiro, Sérvio PontesO Quadrilátero Ferrífero (QF) possui elevada concentração de minérios no solo, o que leva ao alto extrativismo, fato este que se contrapõe à sua importância biológica por desencadear perdas de biodiversidade e de possíveis potenciais biotecnológicos, por exemplo a partir da microbiota. Nesse ambiente, as cavernas ferruginosas se apresentam como paisagens com características geomorfológicas distintas, como diferentes altitudes e composição estrutural. Este trabalho teve como objetivos gerais realizar a predição metabólica funcional (anál. independ. de cult) e prospectar bactérias biocontroladoras e promotoras de crescimento vegetal (BPCV) (métodos dependentes de cultivo) a partir de substratos provenientes de cavernas ferruginosas do QF. Para isso, foram coletadas amostras de piso e teto de sete cavernas ferruginosas, uma amostra de caverna de quartzito e uma amostra de solo externa às cavidades. Inicialmente, foi realizada uma análise em larga escala da sequência do gene 16S rRNA (parte finalizada no mestrado) e a predição funcional (realizada ao longo do doutorado). Em paralelo, foi realizado o isolamento, cultivo e verificação das atividades de biocontrole e biofertilização. Na análise de predição metabólica, categorias de interesse biotecnológico mostraram diferenças estatísticas entre a amostra de caverna quartzítica e as amostras das cavernas ferruginosas, sendo encontradas maiores proporções de sequências para as categorias: mecanismos de transdução de sinal, metabolismo do nitrogênio, biossíntese de novobiocina e sistema de secreção. Um total de 563 isolados cultiváveis foram obtidos, catalogados e cultivados em placas de 96 poços, compondo matrizes de ensaios de inibição in vitro contra os fitopatógenos Xanthomonas citri subsp. citri (Xcc306), Fusarium oxysporum e Colletotrichum lindemuthianum (Cl89). Os resultados mostraram que 47 isolados inibiram Xcc306, sendo que nenhum isolado da amostra de solo externa às cavidades apresentou resultados positivos. Entre os isolados que inibiram o Xcc306 in vitro, nove reduziram entre 36-68% da lesão causada pelo Xcc306 quando co-inoculados em plantas de limão-cravo, sem induzir resposta de hipersensibilidade. Vinte dos 47 inibiram o crescimento de Fusarium sp. diretamente em 51-73% e 15 indiretamente em 75-81%. Esses 15 inibiram o crescimento de Cl89 in vitro (até 93% diretamente e 100% indiretamente), fixaram nitrogênio, produziram proteases e sideróforos, mostraram capacidade de motilidade, produziram biofilme e exceto 1 isolado (A1), todos solubilizaram fosfato inorgânico. Os isolados com propriedades mais relevantes para candidatos a BPCV foram identificados como Serratia sp., Dickeya sp., e Nissabacter sp. Este trabalho apresenta pela primeira vez o potencial bacteriano associado a cavernas ferruginosas previamente desconhecidas para aplicação agrícola e ambiental, como candidatos a potenciais inoculantes biológicos.Item Genomics and walnut hull proteomics of Xanthomonas arboricola pv. juglandis 417 for the development of new disease control.(2021) Assis, Renata de Almeida Barbosa; Moreira, Leandro Marcio; Dandekar, Abhaya M.; Moreira, Leandro Marcio; Ferro, Jesus Aparecido; Souza, Robson Francisco de; Cruz, Izinara Rosse da; Borges, William de CastroXanthomonas arboricola pv. juglandis 417 (Xaj417) is the causal agent of walnut bacterial blight, the most significant above-ground disease of walnuts (Juglans regia L.). Walnut producers have registered losses of up to 40% in local production annually. Disease management uses copper-based pesticides which induce pathogen resistance despite being harmful for the environment. Our aim was to evaluate the genome content of the pathogen, dissect the host-pathogen response to define determinants that regulate the host susceptibility and assess the mutation effect of a conserved secreted protein among plant-associated Xanthomonadaceae. Our study focused on Xaj417 to understand the proteo-genomics attributes to colonize its host. We investigated the genome sequence and proteome of this plant pathogen by performing a comparative analysis with other sequenced Xaj and inoculating walnut fruits with Xaj417. The comparison of 32 Xaj genomes revealed that the adaptive evolution generated by intensive spray application to control bacterial diseases possibly led to selection of resistant bacteria and emergence of pathogenic strains (Chapter I). The results revealed that bacterial virulence and copper resistance emerged by the acquisition of specific sets of pathogenesis-related genes commonly transferred among the members of the Xanthomonas genus on mobile genetic elements. This was evidenced for the reference strain Xaj417, a copper-resistant Californian isolate, that acquired a new copper resistance cassette by HGT associated with a new transposon family in Xanthomonas (TnXaj417). The expansion of mobile genetic elements in the most virulent strains influence the repertoire of virulence effectors and adaptation strategies shaping the evolution of pathogenic strains. On Chapter II, we dissected this pathosystem using tandem mass tag quantitative proteomics. This is the first proteome study of this pathosystem examining the molecular responses during the disease development by comparing the proteomes of infected fruit hulls to healthy tissue. Xaj proteins detected in infected tissues demonstrated its ability to adapt to the host microenvironment, limiting iron availability, coping with copper toxicity, and maintaining energy and intermediary metabolism. Finally, on Chapter III the secreted monofunctional chorismate mutase mutant (XajCM) was created in Xaj417 and showed increased virulence in walnut nuts. The bacterial morphology was characterized and IX changes in the protein profile of the mutant in planta were tested. The proteomic results suggested intense degradation processes, oxidative stress, and general arrest of the biosynthetic metabolism in infected nuts. Overall, this study offers new insights into the emergence of virulence, adaptation, and tolerance to disease management strategies used in orchard ecosystems. It also provides knowledge into molecular mechanisms highlighting potential molecular tools for early detection and disease control strategies.