PPCBIOL - Programa de Pós-graduação em Ciências Biológicas
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Item Avaliação de proteção heteróloga utilizando proteínas recombinantes de Leishmania braziliensis contra a Leishmaniose visceral.(2023) Silva, Felipe Oliveira da; Roatt, Bruno Mendes; Roatt, Bruno Mendes; Costa, Guilherme de Paula; Brito, Rory Cristiane Fortes deA leishmaniose visceral é considerada a forma mais grave dentre as formas clínicas das leishmanioses e até o momento não há uma vacina que possa ser empregada em campanhas de controle e profilaxia dessa doença. Por isso, se torna necessário um estudo aprofundado no ramo da vacinologia para encontrar possíveis candidatos vacinais que evidenciem imunogenicidade e eficácia. As vacinas atuais com maior potencial imunogênico têm origem de proteínas recombinantes, e sua aplicação tem demonstrado uma eficácia quando analisadas em modelos experimentais murinos. Neste contexto, as proteínas Enolase e Hipotética (rLbHyp) foram avaliadas em camundongos e demonstraram potencial imunogênico com uma baixa carga parasitária quando analisado os órgãos que mais são acometidos pela LV (baço, fígado e medula óssea). Dessa forma, ensaios em modelo hamster (Mesocricetus auratus), são indicados e podem contribuir para uma melhor avaliação destas proteínas visto que este modelo apresenta diversas características da doença quando comparados cães e humanos. O objetivo deste estudo foi então avaliar a eficácia de imunização através de uma vacina composta por proteínas recombinantes de Leishmania braziliensis contra a Leishmaniose visceral experimental em modelo hamster Mesocricetus auratus. Para isto, hamsters foram divididos em oito grupos experimentais sendo estes: animais não imunizados (CI), imunizados com saponina (Sap), proteína hipotética (Hip), proteína enolase (Eno), combinação proteína hipotética e enolase (Hip + Eno), imunizados com proteína hipotética + saponina (Vac Hip), proteína enolase + saponina (Vac Eno), e combinação proteína hipotética e enolase + saponina (Vac Hip + Eno). Os animais receberam três doses de imunização, tendo um intervalo de 21 dias entre elas. Logo após a última dose, foram esperados mais 30 dias para a realização do desafio experimental, sendo um inóculo de 2x107 promastigotas de L. infantum pela via intraperitoneal. Logo após, esperou-se 60 dias para realizar a eutanásia desses animais e amostras de sangue, soro, fragmentos do baço foram obtidos para a realização de diferentes análises laboratoriais através de análises hematológicas, imunológicas e parasitológicas. Em relação aos parâmetros hematológicos, leucograma, eritograma e plaquetas, foram observados padrões normais, principalmente nos grupos imunizados com as composições vacinais completas (Vac Hip, Vac Eno e Vac Hip+Eno). A resposta celular nos mostrou uma elevação nas células CD4+ produtoras das citocinas IFN- e TNF e uma redução nos níveis de IL-10 nos grupos imunizados. A análise macroscópica do baço demonstrou uma esplenomegalia nos grupos CI e Sap comparados aos outros grupos experimentais. Estes resultados foram associados aos dados de carga parasitária onde observamos uma redução do parasitismo hepato-esplênicos principalmente nos grupos com as composições vacinais completas. Em vista disso, os resultados apresentados demonstram uma imunogenicidade importante desencadeada principalmente nos grupos imunizados com as composições vacinais completas, mostrando a relevância vacinal das duas proteínas em um modelo de susceptibilidade na LV.Item Avaliação do uso de proteína quimérica associada a miltefosina como estratégia de imunoquimioterapia para o tratamento da leishmaniose visceral em modelo hamster Mesocricetus auratus.(2023) Gonçalves, Letícia Captein; Roatt, Bruno Mendes; Cardoso, Jamille Mirelle de Oliveira; Roatt, Bruno Mendes; Cardoso, Jamille Mirelle de Oliveira; Duarte, Mariana Costa; Barbosa, Maria AndréaA leishmaniose visceral (LV) é classificada como a doença mais severa entre as leishmanioses. Como medidas de controle da doença, o Ministério da Saúde preconiza a administração de tratamento precoce, no entanto, a elevada toxicidade e os custos elevados dos fármacos utilizados constituem fatores limitantes, resultando em taxas significativas de interrupção do tratamento e contribuindo para a formação de cepas resistentes aos medicamentos, elevando a taxa de letalidade da LV. Dessa forma, faz-se necessário novas estratégias para o combate à doença. Dentre essas estratégias destaca-se a imunoquimioterapia, que se caracteriza pela combinação de substâncias biológicas que modulam e ativam a resposta imune em conjunto com substâncias quimioterápicas, reduzindo a toxicidade, a duração do tratamento e os custos associados aos medicamentos. Diante disso, propomos, por meio deste estudo, a comparação de distintos regimes de imunoquimioterapia, usando a associação de proteínas quiméricas associadas ao adjuvante MPL e miltefosina, sob a forma de terapia seriada e isolada, empregando infecção experimental por L. infantum em hamsters Mesocricetus auratus; Foram divididos 9 grupos (i) CI; (ii) Milt14; (iii) Milt28; (iv) MPL Iso; (v) Qui-a MPL Iso; (vi) Qui-a MPL + Milt14 Iso; (vii) MPL S; (viii) Qui-a MPL S; (ix) Qui-a MPL + Milt14 S; Foi realizado a infecção pela via intraperitoneal com 5x107 promastigotas de L. infantum. Se deu início aos regimes de tratamento 60 dias após a infecção, e os animais foram eutanasiados 30 e 90 dias finalizados os tratamentos. Durante esse procedimento, foram coletados fragmentos do baço e fígado, bem como amostras de sangue e soro. Foi observado em relação às análises hematológicas por meio de contagem diferencial, um aumento nos leucócitos nos animais tratados, tanto de forma seriada quanto isolada. Do mesmo modo, foi observado um aumento na produção de IFN-γ e TNF por linfócitos esplênicos totais e CD4+ , nos animais tratados de forma isolada 30 dias pós finalizados o tratamento, já no tempo 90 este aumento foi mais evidente nos grupos tratados de forma seriada, bem como uma redução da interleucina IL-10, estimulando uma resposta celular capaz de controlar o parasitismo tecidual esplênico nestes animais tratados em protocolos isolado ou seriado com a quimera associada ou não ao miltefosina. Sendo a combinação Qui-a MPL + Milt14 S se destaca como uma estratégia promissora a ser utilizada para o tratamento da LV.Item Seleção de potenciais peptídeos para o diagnóstico sorológico da leishmaniose visceral canina por imunoinformática.(2021) Maia, Rodrigo da Costa; Reis, Alexandre Barbosa; Brito, Rory Cristiane Fortes de; Reis, Alexandre Barbosa; Brito, Rory Cristiane Fortes de; Guimarães, Ana Carolina Ramos; Moreira, Leandro MarcioA Leishmaniose Visceral é uma doença negligenciada, com ampla distribuição geográfica, comportamentos ecoepidemiológicos distintos (zoonótica ou antropoótica) e potencialmente fatal quando não tratada. Nas Américas, assim como em parte da Europa apresenta um comportamento zoonótico ou antropozoonótico tendo o cão como principal reservatório do parasito (Leishmania (L.) infantum e seu diagnóstico, no entanto, apresenta limitações principalmente com relação a especificidade e ou sensibilidade dos testes sorológicos utilizados, como é o caso do programa de controle da Leishmaniose Visceral Canina (LVC), executado no Brasil. A fim de contribuir na busca por componentes que possam refinar as técnicas de diagnóstico sorológico, no presente estudo, foram selecionados e avaliados o potencial de peptídeos para serem empregados no imunodiagnóstico da LVC. Para isso, foram selecionados e avaliados, a partir de um banco de dados relacional, peptídeos quanto a: escores em algoritmos de predição de epítopos para células B (BepiPred, BCPred12 e AAP12), função biológica das proteínas as quais esses peptídeos pertenciam por meio de redes de interação proteína-proteína, similaridade, por meio do BLASTp, além de Atracagem (CABSdock) e Dinâmica Molecular (GROMACS). Após isso, foi otimizada e padronizada a técnica de ELISA empregando os peptídeos selecionados. Para tal, foram testadas duas concentrações de peptídeos (0,25 e 0,5μg) assim como três diluições de amostra (1:200;1:400 e 1:600) e as seguintes diluições do conjugado IgG de cão (1:16.000;1:20.000 e 1:24.000). Como resultados, foram selecionados dez peptídeos a partir do banco de dados relacional, todos com escores maiores que 0,5 para todos os algoritmos de predição além de não serem componentes de proteínas intracelulares do parasito. A similaridade entre outras espécies do mesmo gênero foi consideravelmente alta, no entanto para parasitos de outros gêneros os peptídeos em sua maioria mostraram-se com baixa similaridade. Quanto a atracagem, somente dois peptídeos foram classificados como bons modelos em se tratando a qualidade, enquanto os outros oito se enquadraram como ótimos modelos. Durante a simulação de dinâmica molecular observamos valores relativamente altos de Root-Mean-Square Deviation of Atomic Positions RMSD para todos os peptídeos. Na padronização de ELISA foi possível observar que as melhores condições para as avaliações das amostras individualmente, foram as que empregaram a concentração de 0,25 μg dos peptídeos e em diluição plasmática de 1:600 e do conjugado de 1:16.000, respectivamente, mostraram a capacidade dos peptídeos em diferenciar em no mínimo 3 vezes amostras de cães infectados por L. infantum e não infectados. Em suma a seleção dos peptídeos a partir de parâmetros obtidos por bioinformática se mostrou promissora visto o potencial dos peptídeos selecionados, que se apresentavam potenciais para sua utilização futura em teste diagnóstico sorológico de alto desempenho. Neste sentido este trabalho abre perspectivas para prosseguir com estes testes de validação dos antígenos em bancos de soros que possuem diversos perfis de amostras de cães naturalmente infectados, portadores de diferentes manifestações clínicas, cargas parasitárias, antes e após tratamento e intervenção vacinal, ampliando assim as perspectivas de avanços biotecnológicos no campo do diagnóstico sorológico para leishmaniose visceral em especial para LVC.Item Variação temporal de Leishmaniose visceral em área urbana endêmica em função de variáveis climáticas.(2021) Duarte, Rafael Vieira; Vital, Wendel Coura; Ribeiro, Sérvio Pontes; Vital, Wendel Coura; Ribeiro, Sérvio Pontes; Lira Noriega, Andrés; Carneiro, MariângelaA leishmaniose visceral (LV) é uma doença tropical negligenciada e endêmica em diversos países, sendo o Brasil um dos mais importantes mundialmente, responsável por cerca de 97% dos casos no continente americano. Nesse contexto, Belo Horizonte é um dos municípios brasileiros com as maiores taxas de letalidade, apesar de seu grande investimento no controle e prevenção da LV. O presente estudo teve como objetivo analisar a distribuição da doença e investigar a associação entre variáveis climáticas e a expansão da LV em Belo Horizonte. Foram analisados 1.813 casos de LV notificados e confirmados laboratorialmente durante o período de 1994 a 2018. Para avaliar as variações climáticas e a distribuição da LV ao longo do tempo foram utilizados dados climáticos obtidos junto ao Instituto Nacional de Meteorologia. Foram confeccionados mapas de incidência de LV, mostrando que desde o primeiro caso notificado, em 1994, a doença se espalhou pelo município. Desde o primeiro caso em 1994 até o ano de 2003 a doença estava concentrada ao norte da cidade, em áreas das regionais leste, nordeste e norte. De 2004 a 2008 foi observada uma grande expansão da LV por todo município, alcançando todas as regionais. Nos anos seguintes até 2018 ocorreu uma queda na incidência da doença, porém as áreas com maiores taxas foram das regionais norte, leste e nordeste. Os picos de casos ocorreram em 2004, 2006, 2008 e 2017. De 2008 a 2014 houve uma redução considerável no número de casos. A precipitação total explicou significativamente a expansão da LV, com mais casos em função da quantidade de chuvas (ANOVA, F1;23 = 7,96, p < 0,010, Y = 0,000958x + 2,667; R2 = 0,26). Evidenciamos a existência de um componente climático responsável por impulsionar parcialmente a expansão da doença e os picos das taxas de incidência. Sugerimos que ações do Programa de Vigilância e Controle da Leishmaniose Visceral sejam reforçadas em anos com previsão de chuvas acima da média, uma situação cada vez mais frequente no sudeste do Brasil devido às mudanças climáticas globais.Item Imunoterapia empregando diferentes composições vacinais para o tratamento da leishmaniose visceral em modelo hamster Mesocricetus auratus.(2020) Ferreira, Francielle Carvalho; Roatt, Bruno Mendes; Cardoso, Jamille Mirelle de Oliveira; Roatt, Bruno Mendes; Cardoso, Jamille Mirelle de Oliveira; Duarte, Mariana Costa; Borges, William de CastroA leishmaniose visceral (LV), causada pelos protozoários intracelulares Leishmania donovani e Leishmania infantum, é um grave problema de saúde pública no Brasil e no mundo. Na ausência de vacinas preventivas efetivas contra a doença, o tratamento quimioterápico é a principal ferramenta de controle utilizada de forma universal. No entanto, essa estratégia traz bastante consequências, como diversos efeitos adversos graves, necessidade de internação hospitalar e elevado tempo de terapia, o que leva ao abandono do tratamento e o surgimento de cepas de parasitos resistentes. Assim, levando em consideração que a prática quimioterápica convencional na LV humana e canina ainda é um desafio para a saúde pública mundial, a imunoterapia tem ganhado grande atenção na busca por protocolos terapêuticos mais seguros, com menos efeitos adversos e muitas vezes mais efetivos. Dessa forma, o objetivo desse estudo foi avaliar a imunoterapia constituída pelas vacinas terapêuticas LBSap, LBMPL e LBSapMPL para o tratamento da leishmaniose visceral utilizando o hamster Mesocricetus auratus como modelo experimental. Para isso, foram utilizados 128 hamsters machos e fêmeas que foram infectados com 2x107 promastigotas de L. infantum (cepa OP46) por via intraperitoneal. Aproximadamente 60 dias pós infecção, esses animais foram divididos em oito grupos experimentais (n=8 em duplicata): (i) grupo CI (controle infectado), (ii) Grupo Antígeno de L. brasiliensis (LB), (iii) Grupo Saponina (Sap), (iv) Grupo Monofosforil Lipídeo A (MPL), (v) Grupo Saponina + Monofosforil Lipídeo A (SapMPL), (vi) Grupo Antígeno de L. brasiliensis (LB) + Saponina (vacina LBSap), (vii) Grupo Antígeno de L. brasiliensis (LB) + Monofosforil Lipídeo A (vacina LBMPL) e (viii) Grupo Antígeno de L. brasiliensis + Saponina + Monofosforil Lipídeo A (vacina LBSapMPL). Aproximadamente 30 dias após o fim dos protocolos terapêuticos, os animais foram eutanasiados e foi avaliado o perfil hemato-bioquímico, a produção de IgG total anti-Leishmania, o perfil de linfócitos T produtores de citocinas intracitoplasmáticas (IFN-, TNF-, IL-10) e a carga parasitária esplênica. Todos os experimentos foram realizados em duplicata. Nossos principais resultados demonstraram um restabelecimento do quadro hematológico (série vermelha) dos animais submetidos à vacinoterapia com LBSap e LBMPL e de linfócitos no grupo LBMPL. Em relação aos parâmetros bioquímicos observamos uma normalização dos níveis de ureia e creatinina, AST/TGO, proteínas totais e globulinas nos grupos tratados com as vacinas LBSap, LBMPL e LBSapMPL. Os resultados da reatividade de IgG total anti-Leishmania demonstram uma menor reatividade nos grupos LBSap e LBMPL quando comparado aos grupos controles. Em relação à produção de citocinas intracitoplasmáticas, observamos um aumento tanto de linfócitos totais e CD4+ produtores de TNF- quanto de IFN- quanto redução de IL-10 por linfócitos totais e linfócitos CD4+ nos grupos submetidos à vacinoterapia com LBSap, LBMPL e LBSapMPL. De forma interessante, quando quantificamos a carga parasitária no baço, observamos uma redução drástica do parasitismo nos grupos imunotratados com LBSap, LBMPL e LBSapMPL. Nossos resultados sugerem que a imunoterapia utilizando as vacinas LBSap, LBMPL e LBSapMPL promovem um importante restabelecimento da resposta imunológica com consequente controle do parasitismo tecidual nos animais experimentalmente infectados por L. infantum.Item Avaliação da dose-resposta e da associação de adjuvantes na potência de vacinas quiméricas contra leishmaniose visceral : estudo de fase I em camundongos BALB/c.(2020) Ostolin, Thais Lopes Valentim Di Paschoale; Reis, Alexandre Barbosa; Brito, Rory Cristiane Fortes de; Reis, Alexandre Barbosa; Brito, Rory Cristiane Fortes de; Fujiwara, Ricardo Toshio; Borges, William de CastroNo Brasil, a leishmaniose visceral canina (LVC) encontra-se em expansão sendo um sério problema de saúde pública. A alta prevalência de cães infectados reforça a necessidade de uma vacina para ser empregada em campanhas de vacinação de forma profilática. Nesse trabalho foram avaliadas duas quimeras desenhadas a partir do mapeamento de epítopos de células T pertencentes a proteínas de Leishmania infantum descritas na literatura como candidatas vacinais. O objetivo do estudo foi avaliar a dose-resposta e o efeito da associação de adjuvantes na eficácia de vacinas quiméricas contra a leishmaniose visceral em camundongos BALB/c. Os animais foram divididos em 14 grupos Salina, Saponina e Monofosforil lipídio A (SM) e quimeras A e B, nas doses de 5, 10 e 20 g, associados ou não aos adjuvantes. Esses foram imunizados com 3 doses, com intervalo de 15 dias entre as doses, e desafiados com 1x107 promastigotas de L. infantum. Foi avaliada a atividade proliferativa de linfócitos T totais (CD3+ ) e suas subpopulações (CD3+CD4+ e CD3+CD8+ ) e a produção de citocinas intracitoplasmáticas (IL-2, IFN-, TNF-, IL-4 e IL-10) após estímulo com antígeno solúvel de L. infantum (ASLi) por citometria de fluxo. Além disso, foi determinada a produção de óxido nítrico (NO) em sobrenadante de cultura de esplenócitos estimulados com ASLi e produção de imunoglobulinas murinas anti-Leishmania (IgG total, IgG1 e IgG2) no soro dos camundongos por ELISA. A quantificação da carga parasitária foi feita no baço por PCR em tempo real (qPCR). Ambas quimeras nas três doses avaliadas, apresentaram aumento da proliferação de linfócitos T e suas subpopulações quando comparadas ao grupo Salina. Quando associadas aos adjuvantes, o mesmo comportamento foi observado sendo o aumento em comparação aos grupos Salina e SM. Observou-se aumento de células T CD4+ e CD8+ produtoras de IFN-, TNF- e IL-2, enquanto houve redução de IL-4 e IL-10, tanto em A quanto em B nas três doses. Cabe ressaltar, que em B na dose de 5 g associada a SM houve aumento na produção de IFN- e IL-2 e redução de IL-4 e IL-10 pelos linfócitos TCD4+ em comparação ao grupo Salina. Os resultados da reatividade anti-Leishmania, mostraram que as proteínas quiméricas A e B aumentaram a produção de IgG total e IgG2 nas três doses avaliadas. Quando associadas a SM, apenas a proteína quimérica A, mostrou-se reativa. Em relação ao subclasse IgG1, houve aumento nas doses de 5 g e 10 g. E para IgG2 houve diferença significativa das doses de 5 e 10 g com a dose de 20 g. Quando quantificamos a carga parasitária foi observado que as proteínas quiméricas sozinhas não foram capazes de reduzir a carga no baço dos animais. Em contrapartida, quando foram associadas ao sistema SM, houve redução da carga parasitária no baço em todas as doses avaliadas para ambas quimeras. Observou-se aumento na produção de NO em todos grupos que foram imunizados com as quimeras associadas ao sistema SM. Os resultados obtidos foram promissores, demonstrando que mesmo em doses reduzidas as quimeras foram capazes de desencadear uma resposta imunológica satisfatória. Os resultados mostram que as duas quimeras sozinhas e ou associadas ao sistema de adjuvantes foram imunogênicas mesmo em doses reduzidas. Além disso, esse estudo contribuirá para o desenvolvimento de novas vacinas contra a LV.Item Aspectos epidemiológicos da leishmaniose visceral canina no Município de Ouro Preto Minas Gerais Brasil.(2019) Rocha, Ana Maria Sampaio; Coelho, George Luiz Lins Machado; Dias, Edelberto Santos; Reis, Alexandre Barbosa; Souza, Carina Margonari de; Andrade, Hélida Monteiro de; Vital, Wendel Coura; Coelho, George Luiz Lins MachadoAs leishmanioses são um grupo de doenças parasitárias de caráter crônico, que apresentam ampla distribuição geográfica, diversidade de agentes etiológicos, podendo acometer seres humanos e animais. A Leishmaniose Visceral (LV) é a forma mais grave dessa infecção e sua transmissão vem se expandindo para as áreas urbanas. Nessa nova dinâmica de transmissão, o cão tem sido considerado o principal reservatório doméstico. Programas de controle propõem a incorporação de áreas de transmissão esporádica nas ações de vigilância, visando evitar e minimizar a propagação da doença. A proximidade com área endêmica e o não registro de investigação sistemática sobre a LV,fez com que o município de Ouro Preto fosse tratado como se essa infecção não fosse prevalente. O objetivo desse trabalho foi determinar os aspectos epidemiológicos da leishmaniose visceral canina no município de Ouro Preto, Minas Gerais. O estudo foi do tipo transversal amostral (n=726), realizado nos 13 distritos de Ouro Preto e em três localidades. A coleta das amostras caninas foi realizada no ano 2016, tendo como população-alvo os cães domiciliados participantes da campanha de vacinação antirrábica. O material avaliado destes animais foi o soro e o sangue total, coletados por punção venosa. O diagnóstico da infecção por LV foi realizado pelo método ELISA (Kit UFMG), ELISA (Kit Bio-Manguinhos), DPP® e qPCR-kDNA. O estudo entomológico ocorreu durante um ano hidrológico, correlacionando densidade vetorial aos fatores climáticos e à altitude. De modo geral, o inquérito amostral superou a frequência esperada de cães avaliados. A definição da infecção canina por LV por diferentes métodos diagnósticos permitiu observar a baixa concordância dos métodos sorológicos com o método molecular. Assumindo este como referência, o método ELISA (kit Bio-maguinhos) apresentou 37,5% e 62,2% de sensibilidade e especificidade, respectivamente. O mesmo método, porém de fabricante diferente (kit-UFMG), obteve o menor resultado de sensibilidade (19,4%) e a maior especificidade (95,8%). O método imunocromatográfico DPP® também revelou comportamento similar, baixa sensibilidade (50%) e moderada especificidade (87,9%). Os valores do Kappa não ultrapassaram 36,8%. A prevalência da LVC no município de Ouro Preto, considerando a concordância dos métodos sorológicos DPP® e ELISA (Bio-manguinhos), foi de 1,93%. No entanto, considerando o diagnóstico molecular (qPCR-kDNA) a prevalência da infecção foi de 20,0%. A espécie responsável pela infecção dos cães foi a Leishmania infantum. A prevalência da LVC variou significativamente entre as áreas avaliadas e o principal vetor da doença, Lutzomyia longipalpis, foi encontrado em dois distritos do município. Dessa forma, a existência de animais infectados e de vetores é um alerta para o risco de transmissão da doença nessa região.Item Métodos proteômicos aplicados à análise composicional e controle de qualidade da LBSap, preparação vacinal anti Leishmaniose Visceral Canina.(2017) Gasparini, Juliana Pereira Lage da Silveira; Borges, William de Castro; Roatt, Bruno Mendes; Coimbra, Roney Santos; Borges, William de CastroA preparação vacinal LBSap consiste de um antígeno particulado de promastigotas de Leishmania braziliensis (cepa MHOM/BR/1975/M2903), rompidas por sonicação e administradas juntamente com o adjuvante saponina. A partir de estudos de fase clínica I e II em cães, foi demonstrado o potencial imunogênico da LBSap e obtido registro de patente em 2006. Com o início dos testes em escala industrial junto à empresa Ouro Fino Agronegócios, surgiram alguns questionamentos quanto ao controle composicional dessas amostras quando submetidas a diferentes condições tais como filtração terminal do produto, possibilidade de envase do imunobiológico com saponina em mesmo vial e temperatura de estocagem. Este trabalho propõe uma metodologia capaz de avaliar o proteoma total das preparações de LBSap produzidas industrialmente para detecção de variações na composição molecular quando submetida aos diferentes tratamentos. Proteômica shotgun foi ferramenta de escolha para as análises em larga escala empregando-se a cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas (LC-MS, nanoHPLC Q-Exactive). Por meio do software PEAKS Studio e do banco de dados do proteoma de L. braziliensis realizou-se identificação e quantificação label-free obtendo-se no total 1.654 proteínas comuns a essas amostras o que representa 20% do proteoma da leishmania. Os parâmetros de quantificação permitiram a comparação das diferentes formulações e avaliação de reprodutibilidade entre réplicas. No total, 451 grupos de proteínas foram diferencialmente identificados. Diferenças marcantes de quantificação foram encontradas na amostra estocada à 37°C, com diminuição no nível de proteínas possivelmente resultante de degradação, quando comparada às amostras estocadas a 4°C. Experimentos de Western Blotting mostraram que o perfil de imunorreatividade é menor nas amostras contendo saponina e armazenadas à 37ºC, quando comparado às demais, reforçando os achados de degradação. O processo de filtração terminal do produto não afetou significativamente a composição, sendo que apenas 6 proteínas abundantes foram diferencialmente identificadas. A estratégia de proteômica shotgun apresentou-se como uma ferramenta útil para determinação da composição molecular de LBSap e deve direcionar ações para desenvolvimento do controle de qualidade dessa formulação vacinal.Item Avaliação de parâmetros parasitológicos e imunológicos no baço, fígado e em células derivadas de leucócitos circulantes, em cães naturalmente infectados por Leishmania infantum, assintomáticos ou sintomáticos.(2017) Vieira, João Filipe Pereira; Reis, Alexandre Barbosa; Carneiro, Cláudia Martins; Soares, Rodrigo Dian de Oliveira Aguiar; Reis, Alexandre Barbosa; Carvalho, Andréa Teixeira de; Andrade, Hélida Monteiro de; Lana, Marta de; Borges, William de CastroA Leishmaniose Visceral zoonótica é um problema de saúde pública global com uma expansão crescente em várias regiões do mundo. O cão, como principal reservatório doméstico do parasito, apresenta-se como um dos fatores que favorecem a expansão da doença em humanos. Dois dos principais órgãos afetados pela leishmaniose visceral canina (LVC) são o baço e o fígado, que apresentam alterações estruturais, decorrentes da infecção. A célula mais parasitada no contexto da infecção por L. infantum é o macrófago, sendo também a célula mais importante na eliminação de formas amastigotas, através da produção de óxido nítrico (NO), ou espécies reativas de oxigênio (ROS). Dessa forma, nosso estudo buscou avaliar a influência de determinadas citocinas na produção de mediadores microbicidas por macrófagos do baço, fígado e derivados de monócitos circulantes, assim como, a correlação destes fatores imunológicos, com a forma clínica, a carga parasitária e a esplenomegalia no contexto da leishmaniose visceral canina (LVC). Nossa estratégia experimental contou com 27 cães, divididos entre cães não infectados (CNI - n=7), cães infectados assintomáticos (CA - n=10) e cães infectados sintomáticos (CS - n=9). Nos cães infectados, foi avaliada a carga parasitária por qPCR e LDU (Leishman donovan units), sendo observada uma carga parasitária maior no baço e fígado do grupo CS. Foi ainda avaliada a presença e grau de esplenomegalia, por ultrassonografia, sendo verificado que cães do grupo CS, apresentam um maior grau de esplenomegalia, comparativamente a cães do grupo CNI e CA. Para avaliação da resposta imune no baço e fígado, foi realizada por citometria de fluxo uma avaliação ex vivo destes compartimentos. Os resultados demonstraram que em ambos os órgãos existe uma maior população de linfócitos T CD3+ em cães do grupo CA, comparativamente ao grupo CNI. No fígado foi constatado um menor percentual de linfócitos T CD4+ e um maior percentual de linfócitos T CD8+, no grupo CS, relativamente aos grupos CNI e CA. Ao avaliar a produção intracelular de IFN- e IL-4 nas subpopulações de linfócitos T, foi observado que linfócitos T CD4+ do baço e fígado de cães do grupo CA demonstraram uma maior capacidade de produção de IFN-, em comparação aos do grupo CNI e CS. Seguidamente, foram avaliadas por qPCR as expressões de RNAm de várias citocinas associadas com a resistência e susceptibilidade e da enzima iNOS em baço e fígado, tendo sido constatada uma maior expressão de IL-12 em ambos os órgãos de cães do grupo CA, em relação ao grupo CNI. No compartimento esplênico, foi ainda observado um aumento na expressão de iNOS no grupo CA, por comparação aos grupos CNI e CS e um aumento na expressão de IL-10 nos cães do grupo CS, em relação aos grupos CA e CNI. Ainda nos compartimentos esplênico e hepático, foi avaliada a produção de NO e ROS por macrófagos, tendo sido constatada um aumento na frequência de macrófagos produtores de NO em cães do grupo CA, por comparação aos do grupo CNI. Em relação à produção de ROS, foi observada uma maior produção em macrófagos do grupo CA, em relação ao grupo CNI, em ambos os órgãos. Foram ainda realizadas avaliações imunológicas in vitro, em sistemas de co-cultivo incluindo macrófagos derivados de monócitos circulantes após infecção com promastigotas vivos de L. infantum GFP, em cultivo com subpopulações de linfócitos T autólogos (M + CD4+; M + CD8+; M + CD4+ e CD8+). Partindo desses co-cultivos foi concluído que macrófagos do grupo CA apresentaram uma maior redução da taxa e intensidade de infecção quando em co-cultivo com linfócitos T CD4+ e/ou CD8+, além disso foi observada um maior predomínio de linfócitos T CD4+ produzindo IFN- em detrimento de células produtoras de IL-4 nos cães do grupo CA. Além disso, foi constatado qCA apresentaram um maior percentual de macrófagos produtores de NO quando em co-cultivo com linfócitos T CD4+ e linfócitos T CD4+ e CD8+, quando comparados ao grupo CS. Foi ainda, examinada a possível existência de correlações entre os parâmetros avaliados nas diferentes metodologias. Foi assim observada uma íntima correlação entre fatores, tais como, a expressão de IL-12, o percentual de linfócitos T CD4+ produtores de IFN- e o percentual de macrófagos produtores de NO que estão associados à resistência. Por outro lado, fatores tais como a expressão esplênica de IL-10, a esplenomegalia e o parasitismo, são fatores intimamente associados à susceptibilidade perante a infecção por L. infantum. Estes resultados contribuem para o entendimento da imunopatologia da LVC e permitiram identificar marcadores de resistência e susceptibilidade, num contexto clínico e no desenvolvimento de novas formas de diagnóstico e vacinas.Item Infectividade e patogenicidade de diferentes isolados de Leishmania (Leishmania) chagasi obtidos de cães naturalmente infectados.(2016) Oliveira, Lucilene Aparecida Resende; Giunchetti, Rodolfo Cordeiro; Reis, Alexandre Barbosa; Giunchetti, Rodolfo Cordeiro; Machado, Evandro Marques de Menezes; Lana, Marta de; Gontijo, Célia Maria Ferreira; Gontijo, Nelder de FigueiredoNo Brasil, a Leishmaniose Visceral (LV), que tem como agente etiológico a Leishmania chagasi (sinonímia Leishmania infantum), vem sendo amplamente distribuída. O cão se destaca como reservatório doméstico deste parasito, favorecendo sua transmissão no ambiente urbano. Considerando que a transmissão da L. chagasi ocorre necessariamente com a participação dos cães no ambiente urbano, e que muitos deles podem ter sido tratados ou estar em tratamento contra esta infecção, sem induzir cura parasitológica, é possível especular que em ambientes domésticos possam estar circulando cepas com características de resistência ao tratamento, bem como alta infectividade e patogenicidade. Neste contexto, torna-se fundamental a caracterização de isolados de L. chagasi, oriundos de cães naturalmente infectados, bem como o estudo do comportamento in vitro e in vivo destes isolados para identificação de padrões de infectividade e patogenicidade. Dentre os resultados obtidos neste estudo, foi possível confirmar, pela PCR-RFLP, que todos os isolados são da espécie L. chagasi. De forma interessante, o cultivo dos diferentes isolados em linhagem de macrófago canino (DH82) evidenciou perfis distintos de infectividade e carga parasitária. Esta abordagem permitiu identificar os isolados com comportamentos polares in vitro, representados por infectividade e carga parasitária elevada (isolado 616) ou reduzida (isolado 614). Após este estudo inicial in vitro, foi realizado uma análise do perfil de infecção em hamsters, utilizando estes isolados, bem como a cepa padrão PP75 e a cepa selvagem OP46. Em um segundo experimento com estes isolados e com as cepas padrão (PP75 e OP46), os animais de cada um dos grupos foram submetidos a uma intervenção com a administração de Glucantime® em dose subterapêutica. De forma interessante, a taxa de sobrevida nos animais infectados com o isolado 616 foi de 100%, enquanto que para os animais infectados com o isolado 614 (com ou sem intervenção medicamentosa), bem como com o isolado 616 (nos animais que receberam Glucantime®) foi em torno de 50%. De um modo em geral, o isolado 614 induziu: (i) maiores alterações clinicopatológicas, (ii) indicativo de alteração hepática pelas análises bioquímicas, (iii) intenso infiltrado inflamatório no fígado, (iv) elevação da carga parasitária avaliada por qPCR no baço e no fígado. Estes resultados mostraram que o isolado que foi menos infectivo (614) nos ensaios in vitro foi o mais infectivo e patogênico em hamsters. Por outro lado, na presença de infecção com o isolado 616 e com administração de Glucantime®, o perfil da infecção mostrou maior gravidade, alterando, portanto, a evolução da infecção. Em conjunto, os dados obtidos pela análise in vitro em macrófagos caninos da linhagem DH82, a partir de isolados de L. chagasi apresentando perfis polares de infectividade, não refletiram o mesmo padrão nos ensaios in vivo utilizando hamsters. Além disto, foi observado que o tratamento não efetivo da leishmaniose visceral experimental pode induzir alteração no curso da infecção, tornando-a mais agressiva.