PPBIOTEC - Doutorado (Teses)
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Resultados da Pesquisa
Item Avaliação in silico e in vitro do efeito tripanocida de óleos essenciais e desenvolvimento de sistemas nanoestruturados como alternativa terapêutica da doença de Chagas.(2019) Seibert, Janaína Brandão; Santos, Orlando David Henrique dos; Vieira, Paula Melo de Abreu; Alexander, Cameron; Santos, Orlando David Henrique dos; Vieira, Paula Melo de Abreu; Silva, André Talvani Pedrosa da; Costa, Daniela Caldeira; Coelho, Eduardo Antônio Ferraz; Santos, Silvana Maria ElóiA falta de uma terapêutica tripanocida eficiente, principalmente na fase crônica da doença de Chagas e sem a presença de efeitos adversos intensos impulsiona a pesquisa para o desenvolvimento de novos fármacos. As substâncias produzidas através do metabolismo secundário de plantas podem apresentar diferentes efeitos biológicos e serem utilizadas como princípios ativos no tratamento de doenças. Dessa forma, o objetivo desse trabalho foi caracterizar quimicamente os óleos essenciais extraídos das espécies Cymbopogon densiflorus, Cymbopogon nardus, Melaleuca leucadendron e Microlicia graveolens, bem como avaliar a atividade anti-Trypanosoma cruzi dos fármacos livres e após encapsulamento em sistemas nanoestruturados. A obtenção desses óleos ocorreu a partir da hidrodestilação das partes aéreas, com rendimentos em torno de 0,1 a 2,0% de acordo com a espécie. A caracterização realizada através da cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas permitiu a identificação de mais de 90% dos compostos, com presença majoritária de monoterpenos oxigenados. A partir da análise in silico foi possível prever inicialmente que todos os óleos em estudo apresentariam potencial contra o parasito T. cruzi. No entanto, na avaliação in vitro desta atividade utilizando a cepa Tulahuen, somente o óleo de folhas de C. densiflorus se revelou ativo, a partir de uma CI50 sobre o parasito equivalente a 60 μg/mL (IS= 3,8). No ensaio de permeabilidade de membrana do parasito, concentrações superiores a 30 μg/mL de óleo apresentaram diferenças em relação ao controle. Este resultado foi confirmado através da microscopia eletrônica de transmissão. Além disso, sistemas nanoemulsionados, lipossomais e micelares carregados de óleo essencial e/ou benznidazol foram desenvolvidos e apresentaram tamanho em escala nanométrica (<500 nm). A adição dos princípios ativos favoreceu a homogeneidade de distribuição de tamanho para todas as formulações. Além disso, potencial zeta negativo e um pH ácido também definiram as formulações. A estabilidade dos sistemas foi avaliada e apenas os lipossomas contendo ambos os fármacos foram instáveis. As formulações foram capazes de reproduzir a atividade tripanocida apresentada pelo óleo e benznidazol a partir de concentrações inferiores quando comparadas aos fármacos livres. No entanto, as micelas foram caracterizadas pelos maiores índices de seletividade e um efeito sinérgico foi comprovado quando ambos os fármacos foram encapsulados concomitantemente nessa forma farmacêutica. Sendo assim, os resultados desse trabalho demonstram o óleo essencial de folhas de C. densiflorus como candidato potencial ao tratamento da doença de Chagas, o qual é capaz de eliminar o T. cruzi in vitro a partir de baixas concentrações. Em adição, as formas micelares contendo benznidazol podem ser uma alternativa na quimioterapêutica chagásica tanto na sua forma simples, bem como, em combinação com o óleo essencial de C. densiflorus.Item Inovações na produção de enzimas do fungo Chrysoporthe cubensis e seus reflexos na sacarificação do bagaço de cana-de-açúcar.(2018) Albuquerque, Mariana Furtado Granato de; Rezende, Sebastião Tavares de; Guimarães, Valéria Monteze; Rezende, Sebastião Tavares de; Almeida, Maíra Nicolau de; Andrade, Milton Hércules Guerra de; Monteiro, Paulo Sérgio; Brandão, Rogélio LopesO presente trabalho avaliou o efeito de métodos de pré-tratamento, ainda não testados, na hidrólise do bagaço de cana realizada com coquetéis enzimáticos fúngicos produzidos on-site. Além disso, o extrato enzimático de C. cubensis foi melhorado, por meio de alterações em suas condições de cultivo, e as enzimas α-arabinofuranosidases desse fungo foram purificadas, caracterizadas e avaliadas na hidrólise do bagaço de cana-de-açúcar pré-tratado alcalino. Os melhores resultados mostraram que o prétratamento hidrotérmico permitiu a conversão de mais de 60% da glicana pelo blend enzimático C. cubensis-P.pinophilum, além de diminuir a necessidade de hemicelulases no processo. O farelo de trigo se destacou, em relação ao capim elefante e ao bagaço de cana-de-açúcar, como fonte de carbono no crescimento do C. cubensis. O melhor extrato enzimático, obtido a partir do crescimento do fungo em uma mistura do farelo de trigo e farinha de beterraba, na proporção 1:1, se mostrou mais completo e eficiente na sacarificação do bagaço de cana submetido ao pré-tratamento ácido ou alcalino, se comparado ao extrato enzimático obtido com farelo de trigo puro. A partir desse coquetel, foram purificadas e caracterizadas duas α-arabinofuranosidases, denominadas α-Ara1 e α-Ara2. As duas enzimas foram satisfatoriamente estáveis a 50 °C, com meiavidas de 68 e 77 horas, respectivamente, e apresentaram pH e temperatura ótimos próximos a 4,0 e 60 °C. A α-Ara1 foi identificada como membro da família GH51 e a αAra2 como uma GH54. Se comparada à α-Ara1, α-Ara2 apresentou maior atividade específica em diferentes substratos, além de maiores eficiências catalíticas ao atuar sobre substratos naturais e complexos, provavelmente devido à presença do domínio de ligação à carboidrato CBM42, presente na estrutura desse enzima. A suplementação do coquetel comercial Multifect® CL com a α-Ara2 aumentou 1,6 vezes e liberação de glicose e 3,6 vezes a produção de xilose. Resultado idêntico foi observado após a combinação do coquetel comercial com as duas α-arabinofuranosidases purificadas, o que indicou sinergismo entre as mesmas. Portanto, o presente estudo contribui para maior conhecimento dos efeitos de diferentes pré-tratamentos na atuação das enzimas produzidas por C. cubensis, bem como traz algumas inovações relacionadas ao processo de produção de enzimas desse fungo e ao estudo de novas α-arabinofuranosidases com potencial para aplicação na indústria de etanol lignocelulósico.Item Desenvolvimento de carreadores lipídicos constituídos por lípides da flora amazônica com propriedade antioxidante contendo fragrâncias naturais para melhora do odor corpóreo relativo ao envelhecimento cutâneo.(2019) Kaufmann, Giana Thais; Santos, Orlando David Henrique dos; Goulart, Gisele Assis Castro; Santos, Orlando David Henrique dos; Goulart, Gisele Assis Castro; Silva, Elton Luiz; Carneiro, Guilherme; Souza, Gustavo Henrique Bianco de; Vieira Filho, Sidney AugustoCom o envelhecimento cronológico há uma redução dos sistemas intrínsecos antioxidantes da pele, resultando em danos cutâneos e geração de compostos responsáveis pelo odor característico da idade. No intuito de minimizar esses danos, propomos o desenvolvimento de nanopartículas lipídicas (nanopartículas lipídica sólidas- NLS e carreadores lipídicos nanoestruturados – CLN) constituídos de manteigas e óleos extravirgens provenientes da flora amazônica contendo fragrâncias naturais com habilidade de mascarar e harmonizar o odor relativo ao envelhecimento. Para composição da matriz lipídica das nanopartículas, as manteigas de ucuúba e de muru-muru e os óleos de patauá e de castanha-do-Brasil foram avaliados quanto às suas características físico-químicas, composição da fração insaponificável e em ácidos graxos e atividade antioxidante pelos métodos de DPPH, ABTS e proteção do ácido palmitoleico (AP) frente ao esqualeno hidroperóxido (EHP). A manteiga de ucuúba apresentou a maior concentração de fitosteróis (287 mg EC/100g), de compostos fenólicos totais (775 mg EAG/100g) e maiores índices de atividade antioxidante: EC50 de 0,83 mg/mL e 18,74 g ET/kg (DPPH) e 18,87 g ET/kg (ABTS). Com exceção da manteiga de muru-muru, todos os materiais demonstraram atividade antioxidante similar ao BHT frente ao EHP. Foram desenvolvidas 7 fragrâncias com óleos essenciais para cada gênero e avaliadas quanto a capacidade de mascarar e/ou harmonizar o odor relativo a idade e quanto à atividade antioxidante. Todas demonstraram capacidade de mascarar o odor do 2-nonenal sem diferenças significativas (p>0,05), porém as fragrâncias F4 e M4 potencializaram a harmonização do odor deste aldeído, sendo selecionadas. Na otimização da produção das NLS e CLN, com ou sem adição de F4 e M4, foram avaliados 7 tensoativos polihidroxilados, duas técnicas de produção (homogeneização a quente com sonda de ultrassom de alta potência - US e homogeneização por alta pressão - HAP) e duas condições de resfriamento (banho de gelo - BG e temperatura ambiente - TA). Todas as formulações foram avaliadas quanto a eficiência de encapsulação (EE) e recuperação do processo (RP) por CG-EM, tamanho de partículas, índice de polidispersão (PDI), potencial zeta (PZ) e pH em dois tempos: T0 (48 horas após a produção) e T65 (65 dias após a produção). As nanopartículas também foram avaliadas por fracionamento de fluxo assimétrico (AF4), por microscopia eletrônica de transmissão e atividade antioxidante frente ao EHP. Dentre as formulações avaliadas e condições de processo, os CLN-M4 BG apresentaram os melhores resultados: EET0 de 88,8%, EET65 de 63,7% e RP de 92,2. As formulações com F4 produzidas por HAP apresentaram EET0 de 97,5%, EET65 de 73,1% e RP de 32,8%. Todas as formulações produzidas apresentaram tamanho médio inferiores de 170 nm, distribuição monodispersa (≤ 0,3) e PZ acima de 30 mv. Adicionalmente, também apresentaram atividade antioxidante contra o EHP similar ao BHT, o que as torna promissoras como agentes antioxidantes para minimização dos processos oxidativos cutâneos e como sistema preventivo na formação do odor relativo a idade.Item Síntese e funcionalização de nanopartículas inalatórias e avaliação in vitro para tratamento de tuberculose.(2018) Carneiro, Simone Pinto; Santos, Orlando David Henrique dos; Fattal, Elias; Santos, Orlando David Henrique dos; Faraco, André Augusto Gomes; Rúbio, Karina Taciana Santos; Ferreira, Lucas Antônio Miranda; Cota, Renata Guerra de SáA tuberculose é uma doença bacteriana infecciosa considerada um grave problema de saúde pública, por ser classificada como a principal causa de morte no mundo por um único agente infeccioso. A OMS recomenda um protocolo de tratamento eficaz, porém, a terapia convencional requer a administração de altas doses diárias de cada medicamento pela via oral para uma resposta satisfatória do paciente, o que culmina na emergência de efeitos adversos graves, reduzindo a adesão à terapia. Neste contexto, o objetivo deste trabalho é sintetizar e funcionalizar nanopartículas inalatórias destinadas ao tratamento de tuberculose e avaliar, in vitro, suas propriedades físico-químicas, toxicidade e atividade biológica. O trabalho empregou estratégias distintas para o desenvolvimento de nanopartículas contendo fármacos antituberculosos. Uma das estratégias consistiu na aplicação de uma metodologia físico-química, em que carreadores lipídicos nanoestruturados de rifampicina foram obtidos pelo método da microemulsão. Esta nanoformulação foi funcionalizada com um peptídeo modificado baseado na sequência da tuftsina, o qual foi previamente sintetizado em fase sólida e, em seguida, acoplado à superfície das nanopartículas para vetorizar o carreador (NP-pRIF). As nanopartículas foram caracterizadas, confirmando a obtenção de um sistema de liberação monodisperso e estável. Os ensaios em cultura de células demonstraram que a NP-pRIF apresentou um potencial de internalização pelos macrófagos significativamente maior que as nanopartículas de rifampicina sem o peptídeo (NP-RIF). Os estudos de citotoxicidade constataram o potencial não-citotóxico de ambas as formulações (NP-pRIF e NP-RIF) em todas as concentrações testadas. Ainda, a eficácia da formulação foi testada frente ao Mycobacterium tuberculosis e apresentou uma concentração inibitória mínima 2 vezes menor que a requerida por uma solução do fármaco puro. Para viabilizar a administração pulmonar, as suspensões de nanopartículas foram acrescidas de manitol e submetidas à secagem por atomização por spray-drying, dando origem a um pó fino, fluido e caracterizado por microscopia eletrônica de varredura como micropartículas esféricas, com tamanho de partícula entre 2 – 10 μm. Os testes in vitro demonstraram o potencial de redispersão das micropartículas em água e liberação das nanopartículas alojadas em seu interior. A outra estratégia abordada neste trabalho envolveu o emprego de uma metodologia química para proceder à síntese de dois conjugados constituídos por um fármaco antituberculoso (rifampicina ou ácido pirazinoico) e o poli(ácido málico), através de reações de esterificação. Em seguida, os conjugados se auto-agregaram em água para a obtenção dos respectivos nanoconjugados (NC-RIF e NC-PA, respectivamente), confirmados pelas imagens de microscopia eletrônica de transmissão. Os testes em cultura de células demonstraram que ambos os nanoconjugados foram eficientemente internalizados pelos macrófagos e que as formulações não apresentaram potencial citotóxico para a maioria das concentrações testadas. Estas formulações serão futuramente secas em spray-drying para obtenção de micropartículas e viabilização da administração pulmonar. Em conclusão, ambas as estratégias empregadas neste trabalho foram eficientes na obtenção de nanocarreadores inovadores e com potencial para contribuição na otimização do tratamento da tuberculose.Item Proteômica quantitativa baseada em espectrometria de massas para estudo do trato alimentar de Schistosoma mansoni com ênfase na glândula esofagiana e suas secreções.(2018) Neves, Leandro Xavier; Borges, William de Castro; Wilson, R. Alan; Borges, William de Castro; Palmisano, Giuseppe; Castro, Ieso de Miranda; Cota, Renata Guerra de Sá; Marco, Ricardo deA esquistossomose é uma doença tropical negligenciada que afeta mais de 240 milhões de pessoas em 78 países. Apesar dos esforços para erradicação da doença, fatores como baixa cobertura dos programas de tratamento quimioterápico, métodos diagnóstico pouco sensíveis e reinfecções em regiões endêmicas, constituem desafios para o controle da transmissão. O desenvolvimento de vacinas contra schistosomas constitui uma ferramenta alternativa de combate à doença, porém, a identificação de antígenos protetores tem sido um grande desafio. Neste sentido, destaca-se o modelo de auto cura da infecção em macaco Rhesus (Macaca mulatta), no qual observa-se eliminação de parasitos após uma resposta humoral direcionada às interfaces do parasito, como tegumento e secreções da glândula esofagiana. Neste contexto, o presente trabalho teve como objetivo geral a caracterização proteômica em larga escala de produtos da glândula esofagiana e demais secreções do trato alimentar de S. mansoni para proposição de novos alvos vacinais. Uma abordagem quantitativa avaliou a presença de proteínas de interface em homogenato solúvel de vermes adultos, revelando uma baixa representatividade de moléculas de interesse nessa fração. A partir disso, um método de enriquecimento tecidual foi utilizado para a análise detalhada do esôfago de vermes machos adultos. As análises shotgun quantitativas apontaram 628 grupos de proteínas enriquecidos na região esofagiana, incluindo Microexon genes (MEG), hidrolases, glicosil transferases e proteínas para transporte vesicular. Ademais, essa abordagem permitiu a detecção de proteoformas de MEGs geradas por substituição e/ou deleção de resíduos de aminoácidos. Nove proteínas expressas na glândula esofagiana foram selecionadas para quantificação absoluta por QconCAT. A MEG-12 apresentou a maior concentração entre os alvos quantificados. A estimativa do número de cópias por célula das proteínas secretadas sugere que tais moléculas constituem alvos abundantes neste subproteoma. Por último, a caracterização proteômica do sobrenadante de cultura de S. mansoni resultou na detecção de um repertório expandido de proteínas do trato alimentar, incluindo MEGs esofagianas, reforçando a eventual exposição das secreções nessa interface parasito-hospedeiro. Em conjunto, as abordagens proteômicas de caracterização da região esofagiana e trato alimentar de S. mansoni resultaram na identificação de moléculas com potencial aplicação biotecnológica no desenvolvimento de vacinas, bem como alvos terapêuticos.Item Bioprospecção de bactérias de regiões de canga do Quadrilátero Ferrífero : estratégia de busca de alvos com potencial biotecnológico.(2018) Caneschi, Washington Luiz; Moreira, Leandro Marcio; Moreira, Leandro Marcio; Silva, Cynthia Canêdo da; Teixeira, Mônica Cristina; Almeida Junior, Nalvo Franco de; Silva, Silvana de QueirozO extrativismo mineral na região do Quadrilátero Ferrífero brasileiro destruiu grandes áreas de terra, dizimando espécies vegetais e sua microbiota associada. Pouco se sabe sobre a microbiota da região. Assim bactérias cultiváveis associadas a plantas e de solos foram investigadas por seu potencial biotecnológico. Amostras foram coletadas de nove espécies de plantas e seis amostras de solos, sendo 65 isolados bacterianos cultiváveis obtidos. Estes representam predominantemente bacilos gram-positivos (70%) capazes de produzir amilases (55%), proteases (63%), celulases (47%), ácido indolacético (AIA) (46%), sideróforos (26%) e solubilizar fosfato (9%). Além disso, 65% destes foram resistentes à ampicilina, 100% eram sensíveis à tetraciclina e 97% tolerantes a altas concentrações de arsênio. Três isolados foram estudados ainda: o isolado FOB3 (Rosenbergiella sp.) produziu altas concentrações de AIA in vitro na ausência de triptofano, demonstrado pela melhora na germinação de planta e taxa de crescimento onde o isolado estava presente. Os isolados C25 (Acinetobacter sp.) e FG3 (Serratia sp.), tiveram plasmídeos extraídos e inseridos em células de E. coli, onde modificaram o perfil fisiológico das cepas transformadas. A cepa E. coli :: pFG3B apresentou a maior capacidade de produção de biofilme, além de aumento na taxa de replicação, tolerância ao arsênio e atividade de catalase, além de aumentar a integridade do DNA na presença de arsênio. A cepa Serratia sp. teve seu genoma completo sequenciado pela plataforma PacBio sendo identificada como Serratia liquefaciens cepa FG3 (SlFG3). Foi identificado um cromossomo de 5,7 Mpb (5398 genes) e dois plasmídeos com 159 Kbp (179 genes) e 125 Kpb (146 genes). A análise comparativa do genoma de SlFG3 foi realizada com 33 outras espécies de Serratia com genomas completos e revelou a presença de 18 supostas inserções de fagos, permitindo identificar 311 genes únicos para o SlFG3 e um core genome de 417 famílias de proteínas. A análise filogenômica baseada no core genome permitiu agrupar SlFG3 em um clado com outras três linhagens de S. liquefaciens (FDAARGOS125, HUMV21 e ATCC27592) e Serratia proteamaculans 568 (Sp568), que compartilham um core de 3998 famílias de proteínas ortólogas. Entre esses cinco genomas, 75 genes são compartilhados apenas em SlFG3 e S. protemaculans 568, ambos isolados de plantas, e 643 famílias de proteínas são exclusivas de SlFG3. A análise desses genes revelou a presença de uma via completa relacionada à degradação de protocatecuato e compostos cloroaromáticos. Além disso, SlFG3 possui um repertório diversificado de genes associados a NRPs / PKS, um conjunto completo de síntese de celulose e metabolismo oxidativo completo e reparo de DNA. Finalmente, SlFG3 ainda possui genes relacionados à tiolação de RNA e DNA, inserida em uma região de fago que pode proteger os ácidos nucléicos contra diferentes condições de estresse. Esses achados resumem que o SlFG3 parece estar bem adaptada à diferentes situações de estresse impostas por condições extremas além de ser extremamente interessante no estudo de mecanismos molecularese composição gênica que pode ser melhor explorado com alto potencial biotecnológico.Item Análise proteômica da espécie exótica invasora Limnoperna fortunei para fins de prospecção de alvos para o controle e monitoramento.(2018) Sanson, Ananda Lima; Borges, William de Castro; Borges, William de Castro; Sant'Anna, Eneida Maria Eskinazi; Ruiz, Jeronimo Conceição; Borges, Marcia Helena; Silva, Silvana de QueirozA espécie invasora de origem asiática Limnoperna fortunei, conhecida como mexilhão dourado, foi identificada pela primeira vez no Brasil em 1998 no Rio Grande do Sul e, deste então, vem provocando grandes danos econômicos e ambientais, tais como paradas de turbinas em hidrelétricas, entupimento de tubulações, morte de peixes, etc, principalmente por sua capacidade de fixação e proliferação. Neste contexto, o desenvolvimento de métodos capazes de propiciar sua caracterização com vistas ao controle das formas larvais e adultas é de grande interesse econômico, científico e tecnológico. Desde 2014 iniciativas como a elucidação do transcriptoma, genoma mitocondrial e mais recentemente da disponibilidade de dados genômicos dessa espécie tem permitido a aplicação de ferramentas moleculares que permitem estabelecer relações de expressão gênica diferencial frente a exposição a condições ambientais ou agentes diversos. Nesse trabalho, nós reportamos a identificação de 3.233 proteínas de L. fortunei via análise em larga escala (shotgun) empregando-se a cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas (LC-MS/MS). Proteínas de interesse tais como aquelas relacionadas a processos secretórios do parasito bem como vários receptores de membrana representam novos alvos passíveis de intervenção para o controle da espécie. Atenção particular foi dada às subunidades do proteassoma identificadas nesse trabalho. Esse complexo proteolítico é o principal responsável por degradação intracelular de proteínas em eucariotos e constitui alvo interessante para ação de drogas que modulam sua atividade. Neste contexto, o proteassoma 20S de L. fortunei foi obtido em grau satisfatório de homogeneidade e suas atividades peptidásicas avaliadas por meio de peptídeos fluorogênicos. Análises de LC-MS/MS permitiram a identificação de 13 das 14 subunidades que compõem a porção catalítica do proteassoma 20S. Ademais, os dados de proteômica permitiram confirmar a expressão dos principais representantes do sistema proteolítico de degradação intracelular dependente de ubiquitina e proteassoma 26S em L. fortunei. A última abordagem desse trabalho consistiu no bioensaio com a exposição do molusco a diferentes concentrações do moluscicida niclosamida (0,25 a 8,0 mg.L-1) para avaliação das alterações proteômicas induzidas. Ao todo, 46 proteínas diferencialmente expressas entre os indivíduos dos grupos controle e teste foram apontadas. Os resultados obtidos com esta abordagem constituem o primeiro inventário do proteoma expresso da espécie invasora L. fortunei e podem contribuir com a proposição racional de novos alvos moleculares para programas de controle e monitoramento desse bioinvasor.Item Análise poligênica da tolerância ao alumínio em Saccharomyces cerevisiae por mapeamento de QTL.(2018) Mezadri, Hygor; Brandão, Rogélio Lopes; Thevelein, Johan; Dumortier, Françoise; Brandão, Rogélio Lopes; Rosa, Carlos Augusto; Tótola, Marcos Rogério; Cota, Renata Guerra de Sá; Freitas, Renata Nascimento deO bioetanol é um produto de grande importância econômica, principalmente devido a sua utilização como combustível renovável. A levedura Saccharomyces cerevisiae utiliza a sacarose obtida da cana-de-açúcar para produzir bioetanol por fermentação. Alguns fatores diminuem a capacidade fermentativa dessa levedura, por exemplo, a presença de Al3+ no caldo de cana-de-açúcar, levando a um aumento do tempo de fermentação e menor produção de bioetanol. Este trabalho teve como objetivo realizar a análise poligênica da tolerância ao alumínio em Saccharomyces cerevisiae utilizando a técnica de mapeamento de QTLs (Quantitative Trait Locus). Uma triagem entre 840 estirpes de leveduras isoladas de diferentes ambientes foi feita a fim de selecionar uma altamente tolerante ao alumínio. Dentre as estirpes testadas, a levedura denominada Bruggeman Fresh apresentou crescimento e melhor desempenho fermentativo em presença de 5 mM de Al2(SO4)3. A estirpe PE-2, amplamente utilizada na produção de etanol pela indústria brasileira, apresentou uma maior sensibilidade ao alumínio. Estas duas leveduras, Bruggeman Fresh e PE-2, foram escolhidas para a estratégia de análise poligênica para o fenótipo de resistência ao alumínio adotada neste estudo. Após esporulação e dissecação das tétrades, os parentais superior e inferior foram selecionados e cruzados dando origem ao híbrido diploide. Foi realizado um pré-teste em meio sólido contendo alumínio com 658 segregantes obtidos a partir desse híbrido diploide, sendo que 150 segregantes foram selecionados e submetidos ao teste fermentativo. A partir do teste da performance fermentativa em presença de Al2(SO4)3, 30 segregantes foram selecionados como fenótipo superior (alta tolerância ao alumínio). Foi realizada a extração do DNA genômico desses 30 segregantes agrupados e 120 segregantes não selecionados (agrupados randomicamente), assim como das estirpes parentais superior e inferior e sequenciadas. A partir das análises das sequências e mapeamento de QTL foi encontrada uma região no cromossomo VI com grande ligação ao fenótipo de interesse, observado devido à diferença na frequência dos SNPs entre os grupos selecionado e não selecionado. Após a análise de reciprocidade hemizigótica, foi identificado que o gene FAB1 tem um importante papel sobre a tolerância ao alumínio em S. cerevisiae.Item Desenvolvimento de biossensor para detecção direta de Flavivirus utilizando nanobastões de ouro.(2019) Ribeiro, Erica Milena de Castro; Silva, Breno de Mello; Silva, Breno de Mello; Tótola, Antônio Helvécio; Figueiredo, Rute Cunha; Paula, Sérgio Oliveira de; Mosqueira, Vanessa Carla FurtadoA co-circulação de Dengue virus, Zika virus, Yellow fever virus, Chikungunia virus e Mayaro virus tem causado grande impacto na saúde pública brasileira e mundial. Os programas de controle e prevenção de arboviroses e estudos epidemiológicos poderiam ser muito beneficiados e aperfeiçoados com a utilização de metodologias de detecção direta dos vírus em mosquitos, pois possibilitaria uma vigilância mais precisa nas populações de vetores ao longo do tempo. Porém, os métodos de diagnósticos hoje disponíveis, apesar de possuírem alta sensibilidade e especificidade são, em sua maioria, onerosos, demandam treinamento específico para aplicação e interpretação e não provem um diagnóstico rápido. Neste contexto, o desenvolvimento de novas tecnologias de biossensores que apresentem benefícios quanto ao tempo de análise, sensibilidade e simplicidade de manipulação têm sido objeto de pesquisa nas esferas pública e privada. A partir deste fato, este trabalho propõe desenvolver e analisar a eficácia de metodologias de funcionalização de nanobastões de ouro (NBs) com anticorpos específicos anti-DENV2 e anti-flavivirus para testar a capacidade de detecção de ligação anticorpo-partícula viral. A detecção de biomoléculas ligadas às nanopartículas de ouro (AuNPs), tais como proteínas e anticorpos, pode ser feita a partir da análise do seu espectro de absorção. Para isso, nanobastões de ouro foram sintetizados, funcionalizados a 4 mM de polietilenoimina, conjugados a 0,4 μg/mL de anticorpos e incubados com 103 UFP/mL de vírus. Os dados foram obtidos através da leitura da ressonância plasmônica de superfície localizada em espectrômetro de varredura UV-Vis. A síntese dos nanobastões, que utilizou o método de crescimento com sementes com a utilização de diferentes agentes redutores, mostrou-se reprodutível. Além disso, um deslocamento muito expressivo no pico de absorção foi observado quando biossensores contendo anti-flavivirus foram incubados em solução com DENV2 e ZIKV, mas não foi observado após incubação com MAYV, um Alphavirus utilizado como controle negativo. Como esperado, nos biossensores contendo anti-DENV2 o deslocamento foi observado apenas na presença de DENV2, demonstrando a especificidade dos anticorpos utilizados. Na presença de soro humano diluído 1:3200 e macerado de mosquito diluído 8x, contendo DENV2 ou ZIKV, o limite de detecção estimado foi de 100 UFP/mL. Assim, sugere-se que os nanobastões de ouro apresentam potencial para o desenvolvimento de novas metodologias de diagnóstico mais rápidos, precisos e práticos que as técnicas já existentes e viabilizar estudos de vigilância da virologia em mosquitos.Item RNAs não codificadores longos em Schistosoma mansoni : predição e perfil de expressão diferencial no estágio evolutivo de verme adulto.(2018) Oliveira, Victor Fernandes de; Cota, Renata Guerra de Sá; Cota, Renata Guerra de Sá; Freitas, Henrique Cota de; Moreira, Leandro Marcio; Gomes, Matheus de Souza; Borges, William de CastroA esquistossomose é considerada uma doença debilitante de grande impacto socioeconômico no mundo causada por platelmintos do gênero Schistosoma. Uma das principais espécies identificadas nesse gênero é o parasita Schistosoma mansoni, que apresenta um ciclo de vida bastante complexo. Acredita-se que a complexidade dos programas de diferenciação e desenvolvimento observado entre os diferentes estágios evolutivos e ambientes onde o parasita vive seja dependente da regulação da expressão gênica. Os RNAs não codificantes representam uma das principais classes de moléculas que potencialmente controlam a regulação gênica nos níveis: epigenético, transcricional, pós-transcricional e traducional. Esses RNAs são divididos em dois grandes grupos, os RNAs pequenos não codificantes de proteína e os RNAs longos não codificantes (lncRNAs), o foco desse projeto. Os lncRNAs correspondem aos transcritos com mais de 200 nucleotídeos e que não codificam proteínas. Particularmente, estão envolvidos em diversas funções regulatórias celulares, como regular a transcrição, induzir o remodelamento da cromatina e modificações em histonas, originar siRNAs endógenos, modular atividades de proteínas, alterar a localização celular de proteínas, ser precursores de pequenos RNAs, entre outros. A hipótese desse trabalho é que o S. mansoni expresse um conjunto de lncRNAs de forma diferencial através da reprogramação de sua expressão gênica em determinados estágios evolutivos. Para investigá-la foi utilizado um conjunto de dados de RNA-seq disponível para a fase adulta do parasito objetivando: (i) a montagem de um pipeline para identificar e caracterizar lncRNAs a partir de dados de RNA-seq com alta confiança; (ii) classificar os novos lncRNAs preditos utilizando a anotação Gene Ontology; (iii) analisar a expressão de um conjunto de 20 lncRNAs em cercária, esquistossômulos com 3,5h de cultivo in vitro, machos, fêmeas, casal e ovos; (iv) analisar a expressão de lncRNAs em parasitos resistentes ao praziquantel e (v) analisar a expressão de lncRNAs em fígado de camundongo infectado e não infectado com S. mansoni. Foram identificados 170 novos Sm-lncRNAs com termos de ontologia relacionados ao metabolismo, transporte e biossíntese. Quinze dos preditos lncRNAs mostraram expressão diferencial nos estágios avaliados, bem como entre machos e fêmeas. Alguns apresentaram expressão diferencial em parasitos com resistência ao praziquantel e em fígado de camundongos infectados. Esses achados abrem novas perspectivas para estudos funcionais focados em resistência a essa droga e desenvolvimento de biomarcadores específicos para a esquistossomose.