PPCBIOL - Programa de Pós-graduação em Ciências Biológicas
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Resultados da Pesquisa
Item Avaliação da atividade anti-Trypanosoma cruzi in vitro e in vivo da miltefosina em combinação com compostos nitro-heterocíclicos e com derivados azólicos.(2019) Mota, Suianne Letícia Antunes; Bahia, Maria Terezinha; Bahia, Maria Terezinha; Reis, Alexandre Barbosa; Diniz, Lívia de Figueiredo; Soeiro, Maria de Nazaré Correia; Mosqueira, Vanessa Carla FurtadoA terapia combinada e o reposicionamento de fármacos ganharam atenção como uma possível estratégia para superar as deficiências do atual arsenal terapêutico para a doença de Chagas. O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito anti-Trypanosoma cruzi da miltefosina em associação com compostos nitroheterocíclicos (benznidazol e metabólito sulfona do fexinidazol) e com derivados azólicos (posaconazol e ravuconazol). Para evitar efeitos tóxicos a citotoxicidade dos compostos (isolados ou combinados) para as linhagens celulares H9c2 e J774 foi avaliada. Não foi observada citotoxicidade destes compostos para as células hospedeiras nas concentrações próximas ao IC90 de cada fármaco isolado ou em combinação. Em seguida, o efeito in vitro da miltefosina em combinação com compostos nitro- heterocíclicos ou derivados azólicos contra amastigotas das cepas Y e colombiana foi avaliado em um ensaio de 72h, utilizando as mesmas linhagens celulares. Não foi observada uma marcante influência da cepa do parasito nos valores de IC50 ou IC90 para miltefosina e para os compostos nitro-heterocíclicos, sendo o valor de IC50 no máximo 3,4 vezes maior quando células H9c2 foram infectadas pela cepa colombiana e o IC90 no máximo 2.0 vezes. De forma diferente, os valores de IC50 do ravuzonazol e do posaconazol foram 23 e 11,7 vezes maiores para a cepa colombiana, em relação à cepa Y, respectivamente. Os valores de IC90 foram 4.26 e 7.66 vezes maiores para a cepa colombiana quando as células infectadas foram tratadas com ravuconazol e posaconazol, respectivamente. Os valores de IC50 e IC90 não foram influenciados pela célula hospedeira. As interações foram classificadas como aditivas para todas as combinações de drogas avaliadas (somas das concentrações inibitórias fracionárias - ∑ICF> 0,5). No entanto, é importante notar que os valores de ΣFIC para as combinações miltefosina/compostos nitro-heterocíclicos foram sempre <1,0. Diferentemente, os resultados de ΣFIC>1 foram observados na maioria dos experimentos realizados com miltefosina/derivados azólicos. Não foi observada a influência da cepa do parasito ou da célula hospedeira no tipo de interação entre os diferentes compostos. Em seguida, camundongos infectados pela cepa Y foram tratados com 10 doses de 40 mg/kg de miltefosina administradas em dias consecutivos ou alternados e com 20 doses de 50 e 100mg/kg de benznidazol administradas em dias consecutivos. Os fármacos foram administrados em monoterapia e em combinação nas mesmas doses. O tratamento com miltefosina e benznidazol a 50mg/kg em monoterapia levaram à supressão transitória da parasitemia. Os mesmos resultados podem ser observados entre animais tratados com 40mg/kg de miltefosina (dias consecutivos) em combinação com 50mg/kg de benznidazol. No entanto, o tratamento com a mesma dose de miltefosina, administrada em dias alternados, e 50mg/kg de benznidazol foi capaz de curar 62,5% dos animais. A administração de uma dose mais elevada de benznidazol (100mg/kg) e 40mg/kg de miltefosina aumenta significativamente a taxa de cura: 87,5% entre camundongos tratados com miltefosina em dias consecutivos e 100% naqueles que receberam o fármaco em dias em dias alternados. Estes resultados mostram uma interação positiva entre a miltefosina e o benznidazol. No entanto é necessário a avaliação da sua eficácia contra a infecção induzida por outras cepas do parasito, bem como no tratamento da fase crônica da infecção.Item Avaliação da atividade anti-Trypanosoma cruzi do benznidazol veiculado em nanopartículas de carbonato de cálcio.(2018) Faria, Gilson; Bahia, Maria Terezinha; Caldas, Sérgio; Bahia, Maria Terezinha; Machado, Evandro Marques de Menezes; Diniz, Lívia de FigueiredoA doença de Chagas é uma enfermidade causada pelo protozoário Trypanosoma cruzi, o qual pode ser transmitido pelas vias vetorial, oral, congênita, transfusional, dentre outras. Estima- se que cerca de sete milhões de pessoas estejam infectadas no mundo, a maioria na América Latina. O benznidazol (Bz) é o fármaco de escolha, mas provoca sérios efeitos adversos e é menos efetivo nas infecções crônicas. Nanopartículas de carbonato de cálcio (CaCO3) têm se mostrado promissoras, em diversos estudos realizados com patógenos intracelulares. Este estudo teve por objetivo avaliar a atividade tripanocida do Bz veiculado em nanopartículas de CaCO3 contra a cepa Colombiana de T. cruzi, a qual é 100% resistente a este fármaco . As nanopartículas foram sintetizadas e conjugadas com Bz, em cuja preparação foi observado um padrão polidisperso com tamanho médio predominante de ~200 nm. Não foi observada toxicidade em células de mamífero para concentrações de Bz livre ou conjugado às nanopartículas (NanoBz), em concentrações menores ou iguais a 100 g/mL, sendo a concentração inibitória de 50% (IC50) do crescimento celular, em conteúdo de Bz, maior que 100 μg/mL para Bz livre e NanoBz, correspondendo a 600 μg/mL das nanopartículas vazias (Nano0). Com relação à atividade anti-epimastigota in vitro, as NanoBz levaram cerca de 6 dias para induzir taxa de mortalidade semelhante à induzida pelo Bz livre em 48 h. Por outro lado, os testes com amastigotas demonstraram percentual de inibição (PI%) maior que 90% em ambos Bz livre e NanoBz, para as concentrações de Bz correspondentes a até 25 μg/mL, sendo que nas concentrações de 12,5 μg/mL a 3,125 μg/mL foi observada uma tendência das NanoBz induzirem PI% ligeiramente superiores ao Bz livre. Nos ensaios in vivo com camundongos Swiss, os tratamentos foram iniciados aos 10 dias de infecção, sendo administrado o Bz livre, conjugado às nanopartículas, ou associado (livre + conjugado) pelas via oral e intravenosa, em 23 doses intermitentes distribuídas em 50 dias, comparativamente ao esquema clássico oral por 20 dias. As Nano0 não alteraram a evolução da infecção, sendo a curva de parasitemia semelhante ao controle não tratado. As injeções isoladas de Bz livre ou NanoBz não foram capazes de induzir a total supressão da parasitemia durante os tratamentos. Contudo, induziram curvas de parasitemia com picos ~2 e 3 logs, respectivamente, menores que as dos animais-controle. O acompanhamento do peso e a ausência de mortalidade nos grupos tratados sugeriu ausência de toxicidade das nanopartículas; observou-se alta taxa de mortalidade entre os animais não tratados (66,7%). O controle de cura (exame de sange a fresco antes e após imunossupressão e PCR sanguínea e tecidual) demonstrou alta resistência parasitária ao tratamento intravenoso isolado com Bz livre ou NanoBz, provavelmente devido ao baixo teor de Bz (10 mg/kg), resultando em taxas de cura de 0% e 13,7% respectivamente. Por outro lado, as NanoBz associadas ao Bz oral no tratamento intermitente prolongado, mostraram a mais alta taxa de cura (66,7%) e mantiveram os níveis de parasitismo mais baixos. Os níveis de parasitismo cardíaco observados nos animais tratados com Bz livre por via intravenosa, na dose de 10 mg/kg, foram superiores aos dos camundongos tratados com NanoBz, com conteúdo de Bz equivalente, sendo constatada cura em 16,6% destes animais e nenhuma morte; no grupo Bz livre intravenoso, por sua vez, contabilizaram-se 33,3% de óbitos. Assim, conclui-se que a conjugação do Bz com nanopartículas de CaCO3 mostra-se como uma estratégia promissora para potencializar a liberação do Bz no interior das células infectadas, contrapondo-se à baixa permeabilidade tecidual deste fármaco.Item Leishmania amazonensis induz a liberação de IL-1β ao interferir no sistema de sinalização de macrófagos.(2019) Oshiro, Flávio Pignataro; Afonso, Luís Carlos Crocco; Afonso, Luís Carlos Crocco; Gomes, Thiago de Castro; Borges, William de CastroO processo inflamatório, caracterizado pelo recrutamento celular e liberação de citocinas, compreende uma das respostas iniciais do sistema imunológico contra processos de infecção. No caso da infecção causada por parasitos do gênero Leishmania, o recrutamento inicial de células imunes não é capaz de evitar o estabelecimento da leishmaniose, em especial nos casos de infecção por Leishmania amazonensis. Um dos mecanismos utilizados pelo parasito para subverter o sistema imunológico compreende a interferência num sistema de sinalização celular conhecido como sinalização purinérgica, onde moléculas como o ATP extracelular influenciam o prosseguimento da resposta. De forma simplificada, o ATP atua sobre receptores específicos e inicia respostas de caráter pró-inflamatório. Para controlar seus efeitos, enzimas ancoradas à membrana degradam o ATP extracelular à adenosina, capaz de atuar de forma antagônica, resultando em respostas de caráter antiinflamatório. No presente trabalho, procuramos entender qual é o papel do parasito na indução de citocinas no contexto da sinalização purinérgica. Para isso, células mieloides de camundongos C57BL/6 foram diferenciadas, ativadas para a produção da citocina pró-infamatória IL-1β, e infectadas por parasitos da espécie L. amazonensis. O papel de proteínas envolvidas na sinalização purinérgica foi avaliado com o uso de fármacos específicos. Curiosamente, verificamos que L. amazonensis não só é capaz de induzir o aumento da liberação de IL-1β, como potencializa a liberação da citocina por meio da interferência no sistema de sinalização purinérgica de macrófagos. Desse modo, ao inibirmos a sinalização promovida pela adenosina, verificamos uma redução na liberação de IL-1β. Além disso, não ocorreram alterações no que diz respeito à produção dos marcadores pró-inflamatório, TNF e anti-inflamatório, IL-10. Nossos resultados sugerem o estabelecimento de um ambiente que promove o recrutamento de células do sistema imunológico – através da ação da IL-1β –, mas não a ativação dessas células, o que poderia auxiliar o parasito nos processos iniciais de infecção.Item População leucocitária e expressão de CD39 e CD73 durante o curso da infecção por Leishmania amazonensis.(2019) Castro, Renata Alves de Oliveira e; Afonso, Luís Carlos Crocco; Afonso, Luís Carlos Crocco; Roatt, Bruno Mendes; Carneiro, Cláudia Martins; Gomes, Daniel Cláudio de Oliveira; Gonçalves, RicardoO ATP extracelular induz uma resposta inflamatória regulada por sua hidrólise à adenosina pela ação sequencial de CD39 e CD73. A adenosina, por outro lado, induz uma resposta anti- inflamatória. O objetivo deste estudo foi avaliar a cinética de migração celular, a expressão de CD39 e CD73 e a produção de citocinas em linfonodos que drenam uma infecção na orelha por L. amazonensis (103 metacíclicas), no modelo murino. A análise de citocinas (IFN- e IL-10) produzidas por cultura de células de linfonodo drenante nos tempos analisados demonstra um balanço, pró e anti-inflamatório, tanto nos tempos iniciais (baixas em 3 e 1 semana) quanto nos tempos tardios (alta em 7 e 10 semanas). Fotomicrografias das lesões de orelha evidenciam um atraso na formação do processo inflamatório e, a partir de 7 semanas, presença de infiltrado inflamatório misto. A análise por citometria de fluxo mostra aumento da população CD45+ e ectonucleotidases na orelha e linfonodo drenante em 7 e 10 semanas de infecção. Em 3 dias ocorre aumento da população CD45+ e expressão de CD39+ /CD73+ na orelha, independente do grupo analisado, provavelmente devido ao inóculo. No linfonodo, as APCs têm um aumento em 7 e 10 semanas e CD39 e CD73 estão em alta expressão. Na orelha, a população de macrófagos aumenta em 10 semanas de infecção com alta expressão de CD39 ou CD73. Os monócitos inflamatórios aumentam na orelha e linfonodo em 10 semanas com alta de ectonucleotidases. Os neutrófilos aumentam em 7 e 10 semanas no linfonodo e orelha, respectivamente e, têm aumento da expressão das enzimas. Os linfócitos TCD4+ aumentam no linfonodo em 7 semanas e regridem em 10 semanas, enquanto na orelha estão presentes apenas em 10 semanas com aumento da expressão de CD39. No linfonodo a população Treg, tem aumento em 7 e 10 semanas. Tanto na orelha quanto no linfonodo a população CD8+ /CD39+ está aumentada em 10 semanas, em um padrão de exaustão. As células NK estão aumentadas em 7 e 10 semanas no linfonodo e orelha com aumento de ectonucleotidases. Nossos resultados nos permitem concluir que existe correlação entre o aumento da população celular no infiltrado inflamatório da lesão e a expressão de ectonucleotidases durante o curso da infecção por L. amazonensis. Este padrão de enzimas exerce uma regulação importante que suplanta a ação das citocinas. As alterações celulares em linfócitos parecem apontar para uma similaridade entre o local de infecção por este parasito e o ambiente tumoral causada pela modulação do sistema imune por ectonucleotidases.Item Efeito do consumo da polpa de açaí (Euterpe oleracea Mart.) no tratamento da mucosite intestinal induzida por quimioterápico em camundongos.(2017) Silva, Raiana Mendes e; Freitas, Renata Nascimento de; Amaral, Joana Ferreira do; Freitas, Renata Nascimento de; Amaral, Joana Ferreira do; Vieira, Paula Melo de Abreu; Generoso, Simone de VasconcelosA quimioterapia tem como base a utilização de fármacos que agem no metabolismo celular, retardando ou inibindo o crescimento desordenado de células tumorais. O 5- Fluorouracil (5-FU) é uma droga antimetabólica muito utilizada na terapia de diversos tipos de câncer e age inibindo a síntese de DNA e RNA e conduzindo a apoptose das células tumorais e de células saudáveis de tecidos com alta taxa de divisão celular, como o trato gastrintestinal. Um grave efeito colateral deste e de outros quimioterápicos é a mucosite intestinal para a qual não existe ainda um tratamento efetivo. A patobiologia da mucosite intestinal está relacionada com a produção de espécies reativas de oxigênio, fatores de transcrição e mediadores inflamatórios, que por sua vez lesionam a mucosa e culminam na interrupção do tratamento oncológico. O açaí é um fruto rico em polifenóis e tem sido estudado no tratamento de diversas doenças, por possuir propriedades antioxidantes, antiinflamatórias, efeitos antiproliferativos e pró-apoptóticos. Por este motivo, e considerando a falta de estudos sobre os efeitos deste fruto na mucosite, o presente estudo teve como objetivo investigar o efeito terapêutico do consumo de uma dieta suplementada com 2% deaçaí na mucosite intestinal induzida por 5-FU (dose única de 200mg/kg de peso) em camundongos BALB/c fêmeas, após três e sete dias da administração do fármaco. Avaliou-se o efeito da dieta contendo açaí na variação do peso corporal, ingestão alimentar, comprimento e peso do intestino delgado, polifenóis séricos, capacidade antioxidante total do soro (TAC),análise histopatológica dos segmentos intestinais, atividade de mieloperoxidase (MPO) no lavado intestinal, malondialdeído (MDA) no jejuno e IL-1β e IL-4 no íleo. Os resultados mostraram que a mucosite intestinal induziu perda ponderal e redução do consumo alimentar. Além disso, o 5-FU induziu redução da relação vilo/cripta de todos os segmentos intestinais e redução do peso do intestino delgado nos animais eutanasiados três dias após administração do quimioterápico. Nos animais eutanasiados sete dias após indução da mucosite intestinal, foram observadas reduções da relação vilo/cripta no jejuno distal e íleo dos camundongos que receberam 5-FU (MI) em comparação com o grupo que recebeu 5-FU e a dieta suplementada com açaí (MI+Açaí). Não foram observadas diferenças significativas no comprimento do intestino delgado, níveis de IL-1β, MPO, polifenóis e TAC. O tratamento com a dieta contendo açaí não foi capaz de atenuar os efeitos citotóxicos do 5-FU no terceiro dia após administração da droga, mas induziu uma pequena melhora nos aspectos morfométricos no íleo e jejuno distal no sétimo dia após indução da mucosite intestinal.Item Artrite reumatoide experimental : o papel do consumo da polpa de açaí (Euterpe oleracea Mart.) no estresse oxidativo e na inflamação.(2019) Silva, Carla Teixeira; Freitas, Renata Nascimento de; Amaral, Joana Ferreira do; Freitas, Renata Nascimento de; Magalhães, Cíntia Lopes de Brito; Hermsdorff, Helen Hermana Miranda; Peluzio, Maria do Carmo Golveia; Pedrosa, Maria LúciaA artrite reumatoide (AR) é uma doença autoimune caracterizada por inflamação sinovial crônica que conduz a uma destruição articular/óssea e associa-se à incapacitação progressiva, complicações sistêmicas, morbidade e mortalidade precoce. O processo de destruição da articulação observado na artrite reumatoide é mediado por vias intracelulares de sinalização, que envolvem fatores de transcrição, tais como o fator nuclear κB, citocinas, quimiocinas, fatores de crescimento, ligantes celulares, e moléculas de adesão. A produção excessiva de espécies reativas de oxigênio (ERO) pode levar ao aumento da inflamação na AR em humanos e animais. O consumo de alimentos com putativos efeitos funcionais em humanos e modelos experimentais de AR tem mostrado efeitos benéficos no controle dos sintomas O açaí (Euterpe oleracea Mart.), fruto rico em polifenóis, insere-se neste contexto pois apresenta alta capacidade antioxidante e propriedades anti-inflamatórias. Assim, o objetivo deste estudo foi verificar o efeito do consumo da polpa de açaí sobre marcadores do metabolismo oxidativo e inflamatórios de camundongos C57BL/6 portadores de artrite induzida por antígeno (mBSA). Camundongos C57BL/6 fêmeas foram divididos em cinco grupos experimentais: três grupos (C, AR e AÇT) receberam dieta padrão AIN-93M e outros dois (AÇ e AÇP) receberam uma dieta com 2% de açaí, ao longo de 2 semanas. Após este período, foi realizada uma imunização na base da cauda dos animais dos grupos AR, AÇP e AÇT, com emulsão composta por mBSA+CFA+Mycobactrium tuberculosis. Neste momento, o grupo AÇT passou a receber dieta com 2% de açaí. Novamente, após duas semanas, os mesmos animais receberam um desafio intra-articular contendo mBSA. Os animais foram eutanasiados após 24h desse desafio. Camundongos do grupo AR apresentaram aumento na produção de anticorpos anti-mBSA, maior edema de pata e infiltrado inflamatório articular, maior peso de órgãos linfoides, aumento do estresse oxidativo e da produção de citocinas pró- inflamatórias. O consumo de açaí na dieta mostrou efeito protetor sobre a AR, com redução na produção de anticorpos, do edema e infiltrado inflamatório, como consequência da melhora no balanço oxidante/antioxidante local e modulação na produção de citocinas e balanço de células Treg/Th17 de forma sistêmica. Estes resultados mostram a necessidade da realização de mais estudos que melhor esclareçam os mecanismos aqui envolvidos, e apontam para um possível efeito antioxidante e anti-inflamatório do açaí na AR experimental, possibilitando sua utilização como estratégia dietética preventiva e/ou terapêutica para a doença.Item Avaliação da terapia com células tronco mesenquimais da medula óssea na cardiopatia chagásica de cães infectados por Trypanosoma cruzi.(2019) Nascimento, Alvaro Fernando da Silva do; Bahia, Maria Terezinha; Carvalho, Adriana Bastos; Bahia, Maria Terezinha; Roatt, Bruno Mendes; Guedes, Paulo Marcos da Matta; Santos, Silvana Maria Elói; Lima, Wanderson Geraldo deNeste estudo foi avaliada a eficácia das células-tronco mesenquimais (MSCS) de medula óssea, isoladamente ou em combinação com a terapia convencional para insuficiência cardíaca, no tratamento da cardiopatia chagásica crônica. Cães infectados com a cepa VL-10 de Trypanosoma cruzi foram tratados com MSCs de origem autóloga ou alogeneicas. Os animais receberam, em dose única, por via intravenosa, 5 milhões de células/kg entre 6 a 8 meses após a infecção. Adicionalmente, outros grupos de animais receberam o tratamento farmacológico (enalapril 5mg e carvedilol 3,125mg) associado ou não à terapia celular. A avaliação da função cardíaca foi realizada através de ecocardiografias seriadas (antes e 45, 90 e 180 dias após o tratamento). O efeito da terapia celular na intensidade das lesões teciduais foi avaliado por análise quantitativa de miocardite e fibrose no tecido muscular cardíaco (câmaras cardíacas, ápice e septo interventricular) dos animais necropsiados 6-8 meses após os tratamentos. A função sistólica, avaliada pela fração de ejeção, não apresentou diferença significativa entre os animais dos diversos grupos experimentais ao longo do período avaliado. No entanto, a comparação dos valores de FEVE obtidos antes e seis meses após o tratamento mostra diferentes padrões de evolução da função sistólica entre os animais dos diversos grupos experimentais. Os animais não infectados mantiveram a FEVE acima de 40% durante o período de avaliação. Os animais dos grupos MSCAUT, MSCAUT+TF e TF não apresentaram alterações acentuadas na função sistólica no período de acompanhamento. Por outro lado, entre os animais do grupo MSCALO foi observada a redução da percentagem de animais com disfunção sistólica (55% para 22%). Em contraste, um aumento da percentagem de animais com disfunção sistólica (30% para 60%) foi detectado entre animais infectados e não tratados. Além disso, se apenas animais com disfunção sistólica no período prétratamento forem considerados, uma melhora significativa na função sistólica dos animais tratados com MCSALO, em relação aos animais infectados e não tratados, pode ser observada. Em concordância, o tratamento com MSCs foi capaz de reduzir significativamente a miocardite e a fibrose na maioria das regiões cardíacas avaliadas. Além disso, foi observada a redução da apoptose e o aumento da mitose no átrio direito dos animais tratados com MSCS em relação aos animais infectados e não tratados. Diferentemente, o tratamento farmacológico foi capaz induzir a redução da apoptose, mas não de aumentar a mitose no átrio direito dos animais. Em seguida, foi avaliada a expressão dos fatores de transcrição associados às linhagens de células T efetoras Th1 e Th2. Os resultados desta avaliação mostraram que a infecção por T. cruzi induziu uma expressão aumentada de mRNA dos marcadores de resposta Th1 e Th2 no átrio direito de animais. O perfil de resposta imune induzido pela infecção por T. cruzi não foi alterado pelo tratamento com MSCAUT, MSCAUT+TF ou TF. Por outro lado, expressões reduzidas de mRNA para T-bet, IFN-γ, TNFα, CCL5 / CCR5 e expressão aumentada de mRNA para IL-10 foram detectadas no tecido (átrio direito) dos animais tratados com MSCALO. Em geral, os resultados deste estudo mostraram o efeito benéfico do tratamento da cardiopatia chagásica com MSCs, especialmente com MSCS de origem alogeneica. Entretanto, novos estudos, utilizando um maior número de animais com disfunção sistólica no momento do tratamento, devem ser realizados para confirmar o por T. cruzi.Item Farmacocinética e eficácia terapêutica de lactona sesquiterpênica nanoestruturada na doença de Chagas experimental em modelo murino.(2014) Branquinho, Renata Tupinambá; Lana, Marta de; Mosqueira, Vanessa Carla Furtado; Magalhães, Nereide Stela Santos; Coura, José Rodrigues; Bahia, Maria Terezinha; Barcellos, Neila Marcia SilvaA doença de Chagas (DCh) apesar de ser um sério problema de saúde pública na América Latina e cada vez mais constatada em países de outros continentes, ainda permanece negligenciada, pois os fármacos existentes para uso humano são ineficazes e causam graves efeitos colaterais. Os objetivos deste trabalho foram: (i) o desenvolvimento, caracterização e validação de formulações de nanocápsulas (NC) convencionais (PCL NC) e furtivas (PLA-PEG NC) contendo a lactona licnofolida (LIC) obtida de Lychnophora trichocarpha e (ii) o estudo de sua eficácia terapêutica em camundongos infectados com cepas de diferentes perfis de resistência/ susceptibilidade ao Benzonidazol e Nifurtimox (BZ e NF). O isolamento e caracterização da LIC pura foram previamente descritas por Branquinho et al. (2014 a). As NC foram produzidas para melhorar a farmacocinética da LIC, diminuir sua toxicidade, promover sua liberação controlada e melhorar sua eficácia terapêutica. As NC foram produzidas por deposição interfacial de polímero pré-formado nas concentrações de 2,0; 3,0 e 4,0 mg/mL da LIC e NC-branca. Em seguida, as LIC NC foram caracterizadas: o tamanho médio de LIC-PCL NC foi de 175,4-245,2 nm e de LIC-PLA-PEG NC de 105,2-159,2 nm. Para ambas NC e em todas as concentrações, os valores obtidos de índice de polidispersão determinados por espectroscopia de correlação de fótons foram ≤0,25. O potencial zeta determinado por anemometria por laser doppler da LIC-PCL NC foi de -42,7 a -57,1 mV e da LIC-PLA-PEG NC -30,3 a -40,1 mV. A morfologia das formulações foi determinada por microscopia de força atômica. As formulações contendo LIC foram quantificadas e validadas por CLAE-UV, conforme os requisitos estabelecidos pelo ICH, (2005). A porcentagem e eficiência de encapsulação das NC, avaliadas pela técnica de ultrafiltração/ultracentrifugação, foram de aproximadamente 100% para ambas as formulações, indicando que a LIC encontra-se associada ao núcleo oleoso da NC. Uma elevada estabilidade das formulações de LIC-PCL NC e LIC-PLA-PEG NC foi observada por um período de até seis meses. Foi desenvolvido pela primeira vez, um método bioanalítico empregando CLAE-UV, precedido de extração por precipitação de proteínas da LIC em NC contidas em amostras plasmáticas de animais tratados. O método foi validado de acordo com as especificações do FDA e ANVISA, mostrando-se adequado para ser aplicado ao monitoramento farmacocinético (PK) em modelo murino. Os principais parâmetros farmacocinéticos (pk) observados no tratamento dos camundongos com as NC foram ASC, t1/2 , Cl , TMR, . Verificou-se de maneira geral, um prolongamento da circulação plasmática, aumento da ASC e do t1/2 e uma redução do Cl da formulação LIC-PLA-PEG NC em relação à LIC-PCL NC. Os parâmetros PK da LIC livre apresentaram valores estatisticamente inferiores em relação às formulações NC. Os estudos in vivo de eficácia terapêutica foram realizados em camundongos Swiss tratados com LIC-PCL NC, LICPLA-PEG NC e BZ utilizado como fármaco de referência. O efeito de NC-LIC, LIC livre, BZ e controles foram avaliados em animais inoculados com 10.000 tripomastigotas sanguíneos (fase aguda-FA) ou 500 (fase crônicaFC) com as cepas CL, Y, Colombiana e VL-10 (estas duas últimas 100% resistente ao BZ). O tratamento foi administrado via i.v., 2,0 mg/kg/dia e oral 5,0; 8,0 e 12,0 mg/kg/dia, por 20 dias consecutivos e a eficácia terapêutica avaliada por exame de sangue a fresco, hemocultura, PCR e ELISA. Todos os protocolos revelaram atividade parcial da LIC livre e os melhores resultados terapêuticos com a formulação LIC-PLA-PEG NC em relação à LIC-PCL NC e BZ. Os animais infectados com as cepas CL, Y e Colombiana foram tratados na FA com LIC-PCL NC e LIC-PLA-PEG NC, 2,0 mg/kg/dia e BZ 50 mg/kg/dia, via i.v. Foi verificado que nos animais infectados com a cepa CL a parasitemia foi subpatente, ocorreu aumento da sobrevida e ainda 100% de cura com ambas as formulações nanoestruturadas e BZ. Em animais infectados com a cepa Y a cura foi de 62,5% com LICPCL NC, de 100% com LIC-PLA-PEG NC e de 75% com BZ. Nos animais infectados com a cepa Colombiana houve cura de 62,5% apenas com LIC-PLA-PEG NC, acompanhada de significativa redução da parasitemia e aumento da sobrevida. Nos animais infectados com a cepa Y e tratados na FA com as duas formulações de LIC NC, 5,0 mg/kg/dia e BZ 100 mg/kg/dia, via oral, foi verificado cura de 62,5% dos tratados com LIC-PLA-PEG NC e BZ e de 57,2% nos tratados com LIC-PCL NC. Nos animais infectados com a cepa Y e tratados na FC da infecção com a formulação LIC-PLA-PEG NC administrada por via i.v. e oral foram observados índices de cura de 50% e 55%, respectivamente. Este resultado foi estatisticamente superior ao observado com LIC-PCL NC que curou 33% dos animais por via i.v. e 30% por via oral, enquanto nenhum animal tratado com BZ por via i.v. e oral foi curado. Nos animais infectados com a cepa VL-10 tratados na FC com a formulação LIC-PLA-PEG NC, via oral, foi verificado cura de 87,5% dos tratados com a dose de 12,0 mg/kg/dia e de 43% dos tratados com 8,0 mg/kg/dia, enquanto os animais tratados com BZ não foram curados. Este trabalho demonstrou pioneiramente (i) a eficácia terapêutica da LIC in vivo quando livre (ii) em formulações de NC (iii), principalmente quando associada ao polímero PLA-PEG (iv), para o tratamento da DCh experimental tanto na FA (v) quanto na FC (vi) da infecção e com cepas totalmente resistentes ao BZ e NF (vii) . A formulação PLA-PEG NC alterou os parâmetros PK da LIC aumentando a sua concentração plasmática-tempo o que por consequência, aumentou sua eficácia evidenciando o grande potencial da LIC para estudos clínicos no tratamento da DCh especialmente quando associada a determinado nanocarreador.Item Implicações do consumo de dieta hiperlipídica nas respostas defensivas comportamentais associadas às alterações do eixo intestino-encéfalo.(2019) Noronha, Sylvana Izaura Salyba Rendeiro de; Menezes, Rodrigo Cunha Alvim de; Chianca Júnior, Deoclécio Alves; Menezes, Rodrigo Cunha Alvim de; Chianca Júnior, Deoclécio Alves; Aguiar, Daniele Cristina de; Moreira, Fabrício de Araújo; Afonso, Luís Carlos Crocco; Cota, Renata Guerra de SáO sobrepeso e a obesidade são uma pandemia mundial que afeta bilhões de pessoas. Essas condições têm sido associadas a um estado inflamatório crônico de baixo grau, reconhecido enquanto fator de risco para o desenvolvimento de uma variedade de doenças somáticas, bem como transtornos do neurodesenvolvimento, transtornos de ansiedade, transtornos relacionados a eventos traumáticos estressores e transtornos afetivos. A ingestão de DH é uma das razões para mudanças na comunidade microbiana intestinal, e evidências recentes apontam que estas comunidades são fortemente relacionadas à homeostase de diversos órgãos e do SNC. Alterações da microbiota podem ocorrer por uma variedade de razões, dentre eles o tipo de composição química dos alimentos. Nosso grupo relatou anteriormente que a ingestão de uma dieta rica em gordura (DH; 45% de gordura kcal/g) por 9 semanas foi capaz de induzir obesidade em ratos, em paralelo ao aumento da reatividade ao estresse e aumento do comportamento defensivo relacionado à ansiedade. Neste estudo, induzimos ratos à obesidade e investigamos alterações das respostas comportamentais defensivas relacionadas à ansiedade por meio do labirinto em T-elevado (LTE), labirinto em Cruz-elevado (LCE), caixa claro/escuro (CE) e campo aberto (CA). A imunoreatividade-FOS após exposição ao teste comportamental no LTE foi quantificado para esquiva e fuga. Analisamos a produção de citocinas proinflamatórias e expressão gênica em núcleos encefálicos (i.e., hipotálamo e amigdala). Avaliamos a expressão gênica de tph2 e slc6a4 no núcleo dorsal da rafe (DR) e subdivisões adjacentes. Investigamos as respostas termorregulatória da região interscapular e da cauda, durante o estresse e recuperação. Foi feito a caracterização das comunidades microbianas em relação às métricas alfa, beta e taxonômica dos grupos controle e obesos. Demonstramos que nove semanas de ingestão de DH induzem obesidade, em associação à hipertrofia do tecido adiposo abdominal, promove resposta comportamental defensiva do tipo ansiedade, aumenta a produção de proteínas próinflamatórias em núcleos hipotalâmicos e amigdaloides, altera a expressão gênica do IL-4 e seu receptor no hipotálamo, aumenta a expressão gênica de tph2 e slc6a4 em diferentes subdivisões da DR e da porção mediana da rafe, e impacta de forma estrutural as comunidades microbianas intestinal. A obesidade alterou a reatividade das estruturas cerebrais envolvidas no controle de respostas neuroendócrinas, autonômicas e comportamentais, isto é, aumento de células imunorreativas-FOS nos núcleos hipotalâmicos ventricular (PVN), dorsomedial (DMH), ventromedial (VMH) e basolateral da amígdala (BLA). Os resultados obtidos sugerem que a DH induz neuroinflamação, produz excitabilidade nos núcleo encefálicos envolvidos nas respostas neuroendócrinas, autonômicas e comportamentais, e modificam a composição da microbiota intestinal.Item Abordagens moleculares e proteômicas para a caracterização de leveduras resistentes ao manganês II.(2019) Ruas, France Anne Dias; Cota, Renata Guerra de Sá; Cota, Renata Guerra de Sá; Santiago, Aníbal da Fonseca; Silva, Breno de Mello; Rúbio, Karina Taciana Santos; Borges, Marcia HelenaA poluição do meio ambiente pelo metal pesado manganês (Mn) tem aumentado, já que é um subproduto industrial, especialmente de minerações. Estratégias biotecnológicas promissoras para descontaminação têm sido desenvolvidas. A biorremediação, é uma delas, emprega microrganismos, por exemplo, leveduras. O objetivo principal deste estudo foi caracterizar isolados de leveduras quanto aos mecanismos de resistência e capacidade de remoção do íon Mn2+ e descrever como estas respondem ao estresse ambiental alterando seu padrão de expressão proteica. Três leveduras foram isoladas de água proveniente de uma mina de rejeito de mineração, localizada no Quadrilátero Ferrífero-MG e identificadas como Meyerozyma guilliermondii, Meyerozyma caribbica e Rhodotorula mucilaginosa utilizando análise bioquímica, por Auxanograma e filogenética, baseadas no 16S rDNA. A avaliação da capacidade dos isolados removerem íons Mn+2 demonstrou que ambos os gêneros estudados são resistentes ao metal, sendo que a presença de excesso de Mn não interferiu negativamente no crescimento. As Meyerozyma sp. removeram 100% do Mn2+ por processo de biossorção e as Rhodotorula sp. 10%, provavelmente por oxidação. A menor capacidade de remoção do último gênero em relação ao primeiro não o torna menos importante, uma vez que apresenta tolerância e capacidade de remoção a concentrações elevadas de Mn2+ quando comparado a outros. O primeiro relato do proteoma solúvel total e diferencial induzidos por Mn+2 do gênero Meyerozyma sp., bem como das interações proteínaproteína foi realizado a partir da técnica shotgun/bottom-up, em que extratos protéicos de M. guilliermondii contendo as frações solúveis foram obtidos após crescimento nas condições ausência e presença de MnSO4 (0,91 mM). Os peptídeos trípticos foram analisados por cromatografia líquida acoplada a espectrometria de massa (LC-MS/MS), seguida de análises de bioinformática. No proteoma um total de 1257 proteínas foi identificado, sendo que a análise qualitativa demonstrou que dessas 117 eram exclusivas da condição ausência e 69 expressas unicamente na presença de Mn2+ . A análise quantitativa apresentou 71 proteínas upregulated induzidas pelo excesso de Mn2+, em que foram identificados sete enriquecimentos funcionais e 43 vias metabólicas. A maioria das proteínas anotadas na condição presença de Mn2+ está relacionada à atividade de oxidoredutases, resposta ao estresse oxidativo, atividades metabólicas, reparo de DNA e remodelação da expressão de genes. Diante do exposto é possível concluir que as três espécies são tolerantes a alta concentração de Mn2+, a importância compreensão dos processos celulares e dos mecanismos regulatórios moleculares, pois eles permitem o conhecimento dos mecanismos de defesa que minimizam o impacto do metal através da expressão de proteínas antioxidantes, por exemplo, permitindo o ajuste na resposta de defesa associados à tolerância do Mn2+ . Esse conhecimento permitirá estudos futuros e a exploração do potencial biotecnológico em futuros processos de biorremediação.