PPBIOTEC - Programa de Pós-graduação em Biotecnologia
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Resultados da Pesquisa
Item Imunogenicidade de três frações antigênicas de Leishmania amazonensis como candidatos vacinais avaliados em hamster contra leishmaniose visceral.(2015) Amorim, Danielle Rodrigues de; Giunchetti, Rodolfo Cordeiro; Giunchetti, Rodolfo Cordeiro; Estanislau, Juliana de Assis Silva Gomes; Mosqueira, Vanessa Carla FurtadoA Leishmaniose é um conjunto de síndromes complexas e multifacetadas causadas por espécies de protozoários do gênero Leishmania, sendo transmitida através da picada de flebotomíneos infectados. Endêmica em 88 países do mundo estima-se que cerca de 350 milhões de pessoas estão em risco de contrair a doença, e aproximadamente 12 a 14 milhões estão infectadas. Cerca de 500 mil pessoas desenvolvem a forma visceral da doença, sendo que 90% dos casos ocorrem na Índia, Bangladesh, Nepal, Sudão, e no Brasil. Diversos pesquisadores no mundo tem buscado respostas para a prevenção da leishmaniose visceral canina (LVC), através da caracterização de antígenos de espécies de Leishmania, já que o cão é considerado o reservatório doméstico do parasito e um importante elo na cadeia epidemiológica de transmissão da doença. Ainda não existe uma vacina que apresente eficácia vacinal compatível para o controle da LVC e que seja recomendada pelo Ministério da Saúde de nosso país como medida profilática da doença. Considerando o hamster amplamente utilizado como modelo experimental em ensaios vacinais com diversos protocolos anti-Leishmania, estabelecemos uma plataforma para testes rápidos in vivo buscando avaliar simultaneamente diferentes candidatos vacinais. Neste sentido, o presente projeto propôs a avaliação de um ensaio pré-clínico vacinal, em hamsters Mesocricetusauratus, considerando aspectos relacionados à inocuidade, toxicidade e imunogenicidade dos candidatos contra leishmaniose visceral, entre os quais: (i) grupo inoculado com salina 0,85% estéril, (ii) grupo inoculado com adjuvante saponina, (iii) grupo inoculado com antígeno bruto de Leishmania amazonensis(LA), (iv)grupo inoculado comantígeno solúvel de L. amazonensis(LASol), (v) grupo inoculado com antígeno particulado de L. amazonensis (LAPart), (vi) grupo inoculado com antígeno bruto de L. amazonensis associado a saponina (LASap), (vii) grupo inoculado com antígeno solúvel de L. amazonensis associado a saponina (LASapSol)e (viii)grupo inoculado comantígeno particulado de L. amazonensis associado a saponina (LASapPart). Os resultados mostraram que nenhuma das formulações vacinais induziu alterações no local do inóculo ou alterações sistêmicas avaliadas pela inspeção clínica e pelo hemograma. Deste modo, ficou constatado que as diferentes formulações vacinais não induziram hemólise ou anemia nos diferentes grupos avaliados. A análise do leucograma revelou linfocitose restrita apenas aos grupos que receberam antígenos vacinais associados ou não ao adjuvante saponina. De forma semelhante, a análise de antigenicidade revelou aumento dos níveis de IgG total anti-Leishmania, acima do cut-off, nos mesmos grupos que apresentaram linfocitose. A análise do immunoblotting, realizada nas formulações em que foi associado antígeno ao adjuvante saponina (LASap, LASapSol, LASapPart), demonstrou a presença de três bandas imunogênicas com peso molecular próximas de 40 kDa, 30 kDa e bandas entre 20 e 30 kDa. As proteínas encontradas nesse trabalho abrem perspectivas para a análise de novas formulações vacinais contra a leishmaniose visceral.Item Ensaio pré-clínico vacinal em hamsters para análise da imunogenicidade de uma nanoformulação contra a leishmaniose visceral.(2016) Cabrera González, Marco Antonio; Giunchetti, Rodolfo Cordeiro; Mosqueira, Vanessa Carla Furtado; Mosqueira, Vanessa Carla Furtado; Rezende, Simone Aparecida; Araújo, Ricardo NascimentoA leishmaniose visceral é causada pelo parasito Leishmania chagasi (sinonímia L. infantum) e tem como medidas de controle preconizada pelo Ministério da Saúde/Brasil a eutanásia do cão doente, principal reservatório do parasito. Diante do impacto social que este procedimento causa perante a sociedade, o desenvolvimento de uma vacina anti-LVC faz-se necessário e torna uma importante medida de controle da transmissão do parasito ao homem. Deste modo, o objetivo deste estudo foi avaliar o potencial de partículas submicrômicas do polímero ácido poli-D,L-láctico (PLA) e quitosana de baixo peso molecular, como carreadoras de antígenos vacinais contra leishmaniose visceral em modelo hamster. Neste contexto, foi realizado um ensaio pré-clínico vacinal com diferentes grupos experimentais, entre os quais: (i) Controle (solução salina estéril a 0,85%); (ii) Saponina (SAP; 100 μg/dose); (iii) Partícula Submicrométrica Pequena vazia (PSmP); (iv) Partícula Submicrométrica Grande vazia (PSmG); (v) Antígeno bruto de Leishmania amazonensis (LA); (v) Antígeno bruto L. amazonensis associado ao adjuvante saponina (LASAP); (vi) Partícula Submicrométrica Pequena contendo antígeno bruto de L. amazonensis (LAPSmP); e (vii) Partícula Submicrométrica Grande contendo antígeno bruto de L. amazonensis (LAPSmG). Dessa maneira, hamsters (Mesocricetus auratus) machos foram inoculados com três doses, por via subcutânea, em intervalo de 21 dias. O desafio experimental foi realizado com 107 promastigotas em fase estacionária de L. chagasi (cepa C46), após 30 dias da última dose. Nos tempos T0 (Antes da 1º dose), T3 (30 dias após o terceiro inóculo) e T180 (180 dias após desafio experimental com L. chagasi, e imediatamente antes da eutanásia), foram feitas coletas de sangue dos animais por punção cardíaca, para realização de teste de função hepática e renal, hemograma e análise dos níveis de IgG anti-Leishmania. Após a eutanásia dos animais, foram coletados baço e fígado para análise da carga parasitária pela técnica de diluição limitante. Os dados obtidos no presente trabalho mostraram que o emprego do polímero poli-D,L-láctico (PLA) de quitosana formulado em partículas submicrométricas associado ao antígeno bruto de L. amazonensis (formulações LAPSmP e LAPSmG) foram inócuos e seguros para administração em hamsters, além de serem imunogênicos e reduzirem drasticamente o parasitismo tecidual. Esta afirmação é baseada nos seguintes achados: (i) alterações locais e clínicas compatíveis com a manutenção dos animais; (ii) testes de função hepática e renal sem alterações; (iii) ausência de anemia e hemólise induzida durante o protocolo vacinal; (iv) indução de linfocitose após o término do protocolo vacinal, particularmente relacionada a formulação LAPSmG; (v) antigenicidade relacionada a produção de IgG total anti-Leishmania após o término do protocolo vacinal; (vi) redução do tamanho do baço, após o desafio experimental por L. chagasi, particularmente relacionada a formulação LAPSmG; (vii) redução da carga parasitária superior a 97% no baço e no fígado. Estes resultados indicam que o encapsulamento de antígeno bruto de Leishmania é uma estratégia que favorece o estabelecimento de imunogenicidade e a obtenção de elevados níveis de proteção contra a LV.Item Análise da imunogenicidade e eficácia empregando-se as vacinas LBSap, Leishmune®, Leish-Tec® em uma plataforma de testes in vivo.(2013) Mendonça, Ludmila Zanandreis de; Giunchetti, Rodolfo CordeiroÉ consenso que a estratégia mais racional para o controle da leishmaniose visceral, que tem como agente etiológico a Leishmania chagasi (sinonímia L. infantum), seria o emprego de uma vacina que proteja o cão impedindo o seu papel de reservatório doméstico do parasito. Assim, considerando o camundongo como modelo experimental amplamente utilizado em ensaios pré-clínicos vacinais anti-Leishmania, é de extrema importância analisar, neste modelo, candidatos vacinais de forma pareada e simultânea. Neste sentido, este projeto avaliou um ensaio pré-clínico vacinal, para análise comparativa de aspectos relacionados a imunogenicidade e eficácia dos candidatos vacinais contra leishmaniose visceral, entre os quais: Leish-Tec® (LT), Leishmune® (LM) e vacina LBSap (composta de antígeno bruto de L. braziliensis e saponina). Dessa forma, camundongos BALB/c foram imunizados com três doses de cada vacina e, após trinta dias da última dose vacinal, os animais foram desafiados experimentalmente com promastigotas de L. chagasi. Trinta dias após o desafio, os animais foram submetidos a eutanásia. Nos tempos antes da 1° dose vacinal (T0), 14 dias após a 3° dose (T1) e antes da eutanásia (T2), amostras de sangue foram coletadas do plexo orbital para realização do leucograma e avaliação do perfil imunofenotípico, ex vivo, de leucócitos circulantes. O baço e o fígado foram coletados no tempo T2 para avaliação da carga parasitária pela técnica de PCR em tempo real. Os resultados obtidos indicam que todas as vacinas são incócuas e seguras para a administração. Dentre as principais alterações relacionadas ao estabelecimento de mecanismos imunoprotetores destaca-se o aumento dos níveis de células NK CD3-CD49b+ observado em T2 para os diferentes grupos vacinais (LT, LM, LBSap). Além disto, ao se avaliar a imunidade adaptativa, foi observado no grupo LT aumento de linfócitos T totais CD3+ em T2, que pode ser associado ao aumento da subpopulação de linfócitos T CD3+CD4+ no mesmo período. De forma interessante, a imunização com vacina LBSap induziu aumento da população de linfócitos T totais CD3+ tanto após o protocolo vacinal (T1) como após o desafio experimental (T2). Este aumento relatado no grupo LBSap parece ser reflexo da expansão da população de linfócitos T CD4+ nos mesmos tempos (T1 e T2). Semelhantemente, o grupo LM apresentou este mesmo perfil de reposta imune com aumento de linfócitos T CD4+ tanto em T1 como em T2. Este perfil imunofenotípico parece ter favorecido o controle do parasitismo tecidual tanto no baço como no fígado para as diferentes vacinas avaliadas. Neste contexto, foi observada redução da carga parasitária esplênica de 36% (LT), 63% (LM) e 42% (LBSap). Além disto, a análise da carga parasitária hepática revelou redução do parasitismo de 48% (LT), 71% (LM) e 62% (LBSap). Estes resultados parecem indicar o estabelecimento de mecanismos imunoprotetores pelos diferentes imunobiológicos avaliados, compatível com a redução da carga parasitária no baço e figado de camundongos imunizados com as vacinas LT, LM e LBSap. Buscando ampliar a identificação de biomarcadores associados a indução de imunoproteção, será realizada como perspectiva a dosagem de imunoglobulinas anti-Leishmania (IgG, IgG1, IgG2a e IgG2b), bem como a análise do perfil de citocinas.Item Metodologia para ensaios de candidatos vacinais contra leishmaniose visceral canina pelo co-cultivo de linfócitos e macrófagos infectados com Leishmania chagasi.(Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós Graduação, Universidade Federal de Ouro Preto., 2012) Viana, Kelvinson Fernandes; Giunchetti, Rodolfo CordeiroNos últimos 30 anos, a leishmaniose visceral (LV) tem avançado para áreas urbanas e periurbanas, apontando o cão como principal reservatório da L. chagasi (sin. L. infantum). Neste contexto, pesquisadores consideram como consenso que uma vacina contra a leishmaniose visceral canina (LVC) poderia ser uma importante ferramenta no controle tanto da leishmaniose humana como canina. Por esta razão, foi desenvolvido um novo método para avaliar o sistema imune de cães que poderia ser empregado como uma alternativa para se analisar imunogenicidade e níveis de proteção em candidatos vacinais contra a LVC. Para tanto, foram empregadas células mononucleares do sangue periférico CMSP de cães saudáveis para padronização de: (i) condições in vitro de cultivo de monócitos diferenciados em macrófagos de cães (MD-MC) infectados previamente com L. chagasi e avaliados após 3, 24, 48, 72 e 96h da infecção nos tempos de 2, 3, 4 e 5 dias de diferenciação do MD-MC (n=5 cães saudáveis); (ii) purificação de subpopulações de células T (CD4+ e CD8+) considerando a razão de linfócitos:macrófagos variando de 1:5 a 2:1 (n=12 cães saudáveis). Em todos os experimentos foram utilizados sobrenadante de cultura para analisar diferentes biomarcadores imunológicos, tais como: níveis de óxido nítrico, a produção de mieloperoxidase (MPO) e N-acetilglicosaminidase (NAG); citocinas do tipo 1 (IFN-, TNF-, IL-12), tipo 2 (IL-4) e imunomodulatórias (IL-10); e avaliada a frequência do parasitismo e carga parasitária em MD-MC infectados com L. chagasi. Os resultados revelaram que após 5 dias da diferenciação do MD-MC e 72h da infecção por L. chagasi foi observado um melhor perfil morfológico e da habilidade microbicida. Apesar dos níveis de NAG permanecerem praticamente inalterados, a análise do MPO revelou redução significativa no tempo de cinco dias de diferenciação dos MD-MC, indicando a baixa contaminação por granulócitos neste período. Os experimentos de co-cultivo empregando MD-MC e subpopulações de células T mostrou um perfil marcante nos biomarcadores imunológicos e na atividade microbicida, considerando a razão de linfócitos (CD4+ ou CD8+) : macrófagos de 1:2 e 1:1:1 de linfócitos (CD4+ e CD8+) : macrófagos. Assim, nestas condições do co-cultivo foi observado associação entre a produção de óxido nítrico e os níveis de citocinas do tipo 1, tipo 2 e imunomodulatórias com a manutenção de uma frequência de parasitismo intermediária e estabilização da carga parasitária em MD-MC infectados por L. chagasi. Os dados obtidos com a realização deste trabalho estimulam a continuidade dos estudos empregando esta metodologia de MD-MC co-cultivados com células T CD4+ e/ou CD8+ provenientes de CMSP de cães imunizados com candidatos vacinais contra LVC.