PPBIOTEC - Programa de Pós-graduação em Biotecnologia

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Alterações hepatoesplênicas associadas à infecção por Schistosoma mansoni no modelo murino.
(2012) Campos, Jonatan Marques; Borges, William de Castro
A Esquistossomose é uma doença endêmica em vários países, afligindo mais de 207 milhões de pessoas no mundo. É considerada a segunda infecção parasitária mais importante em termos de saúde pública devido ao impacto socio-econômico, podendo ocasionar cerca de 200 mil mortes anualmente. A caracterização do genoma e transcriptoma do Schistosoma mansoni propiciou o emprego de técnicas na área da proteômica as quais vem permitindo maior compreensão da biologia deste parasito em todos os estágios de seu ciclo de vida. Entretanto, até o momento, poucos estudos proteômicos abordaram a relação parasito-hospedeiro. O entendimento desta relação é de fundamental importância para a proposição de novos métodos de diagnóstico, avaliação de prognóstico e tratamento da doença. O presente trabalho teve como foco a análise das alterações no proteoma solúvel de fígado e baço, utilizando o modelo murino de infecção por S. mansoni. A primeira abordagem fundamentou-se na discriminação dos estágios de fase aguda e fase crônica nos animais infectados. Após realização do exame parasitológico de fezes, avaliação das alterações hepatoesplênicas através da relação (% órgão/corpo) e histologia de fígado e baço, foi possível estabelecer que o grupo de animais com 5 semanas de infecção desenvolveu a fase aguda da esquistossomose e animais infectados por 7 semanas apresentaram a fase crônica da doença. A técnica de eletroforese bidimensional comparativa, para proteínas solúveis de fígado e baço de animais controles e infectados, demonstrou alterações nos níveis de expressão de proteínas associadas com processos e vias bioquímicas diversas, como resposta ao estresse celular, tradução, ciclo da uréia e via glicolítica. No fígado, a categoria de proteínas chaperoninas apresentou maior número de representantes com alteração de expressão dentre as quais se destacam GRP-78 (proteína reguladora de glicose 78 kDa), HSP-71 (proteína de choque térmico 71 kDa), Erp-60 (calreticulina) e PDI (proteína dissulfeto isomerase). Por outro lado, proteínas como a CPSase I (carbamoil fosfato sintetase I), albumina, indoletilamina N-metiltransferase, peroxirredoxina-6 e anidrase carbônica III apresentaram expressão diminuída no fígado em decorrência da infecção. O perfil proteômico do fígado do animal infectado correlacionou-se com a análise histológica do órgão na qual se observa uma intensa resposta imune celular. No baço, as proteínas identificadas com alteração de expressão foram calreticulina, fosfoglicerato quinase I, frutose-bifosfato aldolase A, gliceraldeído 3 fosfato desidrogenase, EF-Tu, (fator de elongamento) e aspartato aminotransferase. Em geral, as proteínas diferencialmente presentes no baço de animais infectados apresentaram aumento de expressão, sendo o perfil molecular compatível com a demanda de produção de energia e síntese proteica. Estes dois processos são altamente relevantes para o custeio da intensa proliferação celular observada no órgão. Coletivamente, os resultados obtidos demonstraram que a abordagem proteômica empregada permitiu a identificação de marcadores teciduais induzidos pela infecção por S. mansoni. Abordagens futuras permitirão estabelecer se as alterações teciduais decorrentes da infecção pelo parasito alteram significativamente o proteoma plasmático a ponto de indicar novos biomarcadores da esquistossomose.
Análise composicional e quantitativa do soroproteoma na infecção experimental por Schistosoma mansoni.
(2019) Silva, Gustavo Gonçalves; Borges, William de Castro; Borges, William de Castro; Cardoso, Leonardo Máximo; Borges, Marcia Helena
A esquistossomose é uma doença tropical negligenciada presente em 78 países. Cerca de 200 milhões de pessoas estão infectadas com parasitos do gênero Schistosoma, expondo um número muito maior de indivíduos ao risco de infecção. No decorrer da doença os vermes regurgitam os subprodutos de sua digestão, liberando proteínas na corrente sanguínea do hospedeiro. O conteúdo proteico do plasma é uma excelente fonte de informação para compreender melhor a doença no hospedeiro vertebrado. Abordagens proteômicas utilizando o plasma de indivíduos infectados podem contribuir para o entendimento de como os parasitos modificam ou induzem alterações no proteoma plasmático do hospedeiro. Essas investigações também podem ser úteis na busca de novos biomarcadores da esquistossomose. O objetivo deste projeto foi avaliar o proteoma plasmático e soroproteoma de camundongos na infecção experimental por Schistosoma mansoni, para o entendimento da relação parasito-hospedeiro e prospecção de novos alvos para o diagnóstico da doença. Amostras de plasma e soro de camundongos BALB/c e C57BL6 infectados e não infectados, foram colhidas nos períodos 5 e 7 semanas de infecção. As amostras foram investigadas utilizando 1D e 2D SDS PAGE e Western Blotting. Adicionalmente, proteômica em larga escala, baseada em espectrometria de massas foi utilizada para avaliação composicional e quantitativa das amostras investigadas. Em paralelo, métodos para aumentar a exploração do proteoma sérico foram utilizados para o enriquecimento de constituintes de baixa abundância, no intuito de aumentar o repertório de moléculas relacionadas à infecção. Os perfis uni e bidimensional das amostras de plasma e soro demonstraram diferenças entre as condições controle e infectado nos dois períodos investigados. Com a análise proteômica composicional em larga escala realizada por meio de espectrometria de massas, obteve-se a identificação de 362 constituintes. A análise quantitativa demonstrou 129 proteínas diferencialmente expressas, das quais 117 apresentaram aumento de expressão nas condições infectadas. A maioria das moléculas reguladas positivamente nessas condições pode estar associada com a resposta do hospedeiro frente à presença conjunta de parasitos e ovos nos tecidos. A dominância de algumas proteínas plasmáticas representa um desafio para a identificação de moléculas menos abundantes, os métodos de depleção empregados nesse estudo podem representar novas estratégias para identificação de biomarcadores da infecção por S. mansoni.
Análise da atividade antiviral de compostos derivados de naftoquinonas naturais e sintéticas sobre a replicação de Dengue virus em modelo in vitro.
(2016) Silveira, Paola Faria da; Silva, Breno de Mello; Brandão, Geraldo Célio; Souza, Gustavo Henrique Bianco de; Magalhães, José Carlos de
O Dengue virus (DENV) possui quatro sorotipos diferentes (1-4) que são principalmente transmitidos pelo mosquito Aedes aegypti. A infecção resulta na patogênese da dengue, que é uma epidemia de proporções globais. Apesar dos esforços, ainda não existe uma vacina eficaz contra os quatro sorotipos, bem como drogas eficientes no tratamento de pacientes. Portanto, vários estudos tem sido conduzidos na busca de fármacos com atividade antiviral contra o DENV e outros Flavivirus. Dentre os compostos estudados para este fim, estão as naftoquinonas, metabólitos secundários produzidos por algas, fungos, plantas e animais. Estes compostos podem ser extraídos principalmente a partir de plantas do gênero Tabebuia (família Bignoniaceae), são caracterizados por apresentar atividade antiviral, destacando-se a ß-lapachona, potente inibidor da enzima transcriptase reversa dos vírus mieloblastose aviária (AMV) e leucemia murina de Rauscher (RLV). O objetivo deste trabalho foi testar oito diferentes compostos derivados de naftoquinonas sintéticas e naturais com potencial atividade antiviral contra DENV. Para isso, uma triagem foi realizada por redução de MTT (brometo de 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-brometo difenil tetrazolina) para avaliar a atividade citotóxica de oito compostos na linhagem celular BHK-21, resultando no cálculo da concentração citotóxica 50% (CC50) e as concentrações não citotóxicas a serem utilizada em testes subsequentes para os compostos A1, A2, A3, A4, A5, A6, A7 e A8 (lapachol, β-lapachona, 2-Hidroxi-3-(β,β-dimetilvinil)-1,4-naftoquinona, 2-Cloro-1,4-naftoquinona e 4 derivados de lapachol). Em seguida, células BHK-21 foram incubadas com os compostos em concentrações não citotóxicas em diferentes diluições e infectadas com os sorotipos 1 e 2 DENV na multiplicidade de infecção (MOI) de 5 e 2 para os sorotipos 1 e 2, respectivamente. A atividade antiviral foi testada através da análise de redução de MTT e pela titulação de virus liberados no sobrenadante. Apesar de alguns compostos terem apresentado redução de até uma unidade logarítmica no número de partículas virais, os resultados indicaram que estes fármacos não demonstraram atividade antiviral nas condições experimentais testadas.
Análise da biocompatilidade de suporte celular produzido a partir de colágeno tipo I e nanotubos de carbono de paredes múltiplas hibridizados ou não com nanobastões de ouro.
(2019) Gontijo, Daniele de Oliveira; Oliveira, Laser Antônio Machado de; Nogueira, Katiane de Oliveira Pinto Coelho; Oliveira, Laser Antônio Machado de; Silva, Breno de Mello; Menezes, Cristiane Alves da Silva
O desenvolvimento acelerado da nanotecnologia tem aberto novas possibilidades no campo da engenharia de tecidos. Nanotubos de carbono (NTC) em especial têm despertado grande interesse por serem, ao mesmo tempo, mecanicamente resistentes, leves, flexíveis, apresentarem estrutura similar a componentes da matriz extracelular, possuírem alta estabilidade química, bem como possuir alta condutividade elétrica, o que possibilita sua funcionalização com moléculas que possam contribuir para a regeneração tecidual. No entanto, estudos mais abrangentes são necessários para esclarecer a biocompatibilidade desses novos substratos. Neste trabalho, avaliou-se a biocompatibilidade de dois modelos de suporte celular propostos para aplicação biomédica na regeneração tecidual, um a base de colágeno tipo I e nanotubos de carbono de paredes múltiplas (NTCPM) e outro a base de colágeno I e nanotubos de carbono de paredes múltiplas hibridizados com nanobastões de ouro (NTCPMs/AuNBs). Com o objetivo de verificar a interferência destes suportes nas diferentes funções celulares e possível citotoxicidade, foram realizados ensaios de migração, proliferação e viabilidade celular utilizando fibroblastos de linhagem 3T3 e os suportes celulares descritos, bem como análises da interação das células com o suporte a base de colágeno I e NTCPMs por microscopia eletrônica de varredura. Através da análise de migração em suporte celular a base de gel de colágeno tipo I observou-se o modelo Flat como o melhor modelo de estudo. Em suportes celulares a base de colágeno tipo I e a base de colágeno tipo I associado à nanotubos de carbono em todas as concentrações dos dois componentes observou-se migração celular sendo as concentrações mais adequadas para esta análise as de 2,2 mg/ml para colágeno tipo I e 0,6% para NTCPMs. Análise de proliferação celular demonstraram que em suporte celular a base de gel de colágeno do tipo I a melhor concentração foi de 2,0 mg/mL; para NTCPMs não houve diferença estatística entre as concentrações entre os grupos testados. A análise de viabilidade não demonstrou diferença entre as concentrações de suporte celular a base de gel de colágeno do tipo I. A adição de NTCPM, em diferentes concentrações, ao suporte celular de gel de colágeno não interferiu com a viabilidade celular. Em suportes celulares a base de colágeno tipo I associado à NTCPMs/AuNBs, a migração celular foi afetada significativamente. Através da análise de proliferação celular, observou-se que a única concentração que permitiu a proliferação celular foi a de 0,6% mas em taxa muito inferior quando comparada com o grupo controle. Através da análise de viabilidade celular, observou-se morte celular progressiva conforme aumento na concentração do nanomaterial. Compreende-se o NTCPMs/AuNBs como citotóxico, através da metodologia empregada, sendo necessário maiores estudos a fim de definir métodos para tornar possível sua aplicação na engenharia de tecidos. MEV de fibroblastos inseridos em suporte a base de colágeno I e NTCPMs demostrou interação entre as células e o biocompósito. Os resultados obtidos corroboram para o entendimento de que o suporte a base de colágeno I e NTCPMs é biocompatível através das análises realizadas, possuindo assim alto potencial para a aplicação na regeneração tecidual.
Análise da imunogenicidade e eficácia empregando-se as vacinas LBSap, Leishmune®, Leish-Tec® em uma plataforma de testes in vivo.
(2013) Mendonça, Ludmila Zanandreis de; Giunchetti, Rodolfo Cordeiro
É consenso que a estratégia mais racional para o controle da leishmaniose visceral, que tem como agente etiológico a Leishmania chagasi (sinonímia L. infantum), seria o emprego de uma vacina que proteja o cão impedindo o seu papel de reservatório doméstico do parasito. Assim, considerando o camundongo como modelo experimental amplamente utilizado em ensaios pré-clínicos vacinais anti-Leishmania, é de extrema importância analisar, neste modelo, candidatos vacinais de forma pareada e simultânea. Neste sentido, este projeto avaliou um ensaio pré-clínico vacinal, para análise comparativa de aspectos relacionados a imunogenicidade e eficácia dos candidatos vacinais contra leishmaniose visceral, entre os quais: Leish-Tec® (LT), Leishmune® (LM) e vacina LBSap (composta de antígeno bruto de L. braziliensis e saponina). Dessa forma, camundongos BALB/c foram imunizados com três doses de cada vacina e, após trinta dias da última dose vacinal, os animais foram desafiados experimentalmente com promastigotas de L. chagasi. Trinta dias após o desafio, os animais foram submetidos a eutanásia. Nos tempos antes da 1° dose vacinal (T0), 14 dias após a 3° dose (T1) e antes da eutanásia (T2), amostras de sangue foram coletadas do plexo orbital para realização do leucograma e avaliação do perfil imunofenotípico, ex vivo, de leucócitos circulantes. O baço e o fígado foram coletados no tempo T2 para avaliação da carga parasitária pela técnica de PCR em tempo real. Os resultados obtidos indicam que todas as vacinas são incócuas e seguras para a administração. Dentre as principais alterações relacionadas ao estabelecimento de mecanismos imunoprotetores destaca-se o aumento dos níveis de células NK CD3-CD49b+ observado em T2 para os diferentes grupos vacinais (LT, LM, LBSap). Além disto, ao se avaliar a imunidade adaptativa, foi observado no grupo LT aumento de linfócitos T totais CD3+ em T2, que pode ser associado ao aumento da subpopulação de linfócitos T CD3+CD4+ no mesmo período. De forma interessante, a imunização com vacina LBSap induziu aumento da população de linfócitos T totais CD3+ tanto após o protocolo vacinal (T1) como após o desafio experimental (T2). Este aumento relatado no grupo LBSap parece ser reflexo da expansão da população de linfócitos T CD4+ nos mesmos tempos (T1 e T2). Semelhantemente, o grupo LM apresentou este mesmo perfil de reposta imune com aumento de linfócitos T CD4+ tanto em T1 como em T2. Este perfil imunofenotípico parece ter favorecido o controle do parasitismo tecidual tanto no baço como no fígado para as diferentes vacinas avaliadas. Neste contexto, foi observada redução da carga parasitária esplênica de 36% (LT), 63% (LM) e 42% (LBSap). Além disto, a análise da carga parasitária hepática revelou redução do parasitismo de 48% (LT), 71% (LM) e 62% (LBSap). Estes resultados parecem indicar o estabelecimento de mecanismos imunoprotetores pelos diferentes imunobiológicos avaliados, compatível com a redução da carga parasitária no baço e figado de camundongos imunizados com as vacinas LT, LM e LBSap. Buscando ampliar a identificação de biomarcadores associados a indução de imunoproteção, será realizada como perspectiva a dosagem de imunoglobulinas anti-Leishmania (IgG, IgG1, IgG2a e IgG2b), bem como a análise do perfil de citocinas.
Análise de elementos moduladores dos níveis da enzima COX-2 em células H9c2 infectadas com Trypanosoma cruzi; cepa Berenice-62.
(2014) Mota, Suianne Letícia Antunes; Moraes, Karen Cristiane Martinez de
A doença de Chagas, causada pelo protozoário Trypanosoma cruzi, é responsável por uma significante mortalidade e morbidade nas Américas Central e do Sul, afetando um número significativo da população mundial. A doença desenvolveu-se ao longo de décadas e a presença de mediadores inflamatórios e a hipertrofia cardíaca são características comuns. Buscando uma compreensão dos mecanismos moleculares que ocorrem no processo inflamatório e que subsidiem a caracterização de marcadores moleculares na patologia chagásica, a proteína COX-2 tornou se objeto de estudo. Sabe- se que a regulação desta proteína pode se dar a nível transcricional e/ou pós traducional, envolvendo um conjunto de fatores protéicos e incluindo a participação de miRNAs. Estudos recentes tem mostrado uma possível co-regulação indireta entre os níveis de PTEN e de COX-2, mas até o momento, os resultados preliminares ainda não elucidaram esses mecanismos. Particularmente, em relação à Doença de Chagas, poucos são os estudos que focam na elucidação do processamento do mRNAs na doença e nos fatores que co-regulam a proteína COX-2. Sendo assim, objetivou se nesse estudo analisar os moduladores do processo pró-inflamatório/ hipertrófico em células H9c2 infectadas pela cepa Berenice-62 do T.cruzi, buscando a caracterização de marcadores moleculares do processo inicial da Doença de Chagas. Para isso, os tempos de infecção de 0, 2, 6, 12, 24 e 48 horas foram estudados, logo após 2 horas de interação com o parasito. A comprovação da infectividade foi feita por ensaios de microscopia pela coloração com Giemsa e Dapi. A análise transcricional de genes correlatos ao processo inflamatório/ hipertrófico e de microRNAs foram realizados por ensaios de qRT-PCRs e as análises das proteínas COX-2, PTEN, P-PTEN foram investigadas nos ensaios de Western blots. Outros ensaios bioquímicos, como o de viabilidade celular e o de mensuração de prostaglandina E2, foram realizados. Com os resultados, conclui-se que a infecção com a cepa Be-62 diminui a viabilidade celular após 48 horas de infecção e modula os níveis de expressão dos marcadores de hipertrofia cardíaca Anf, Bnp e β –myhc, além de modular o ambiente pró-inflamatório nos intervalos iniciais de infecção, considerando-se o aumento da expressão e da atividade da proteína COX-2 e no aumento na produção de PGE2. Os resultados também demonstraram uma relação entre os genes Cox-2, Pten, Akt, sugerindo uma possível correlação cruzada entre COX-2 e PTEN. Os microRNAs-26b, -463,-1 e -21, respectivamente, indicaram uma possível regulação pós-traducional das proteínas COX-2 e PTEN, demonstrando um papel fundamental na instalação do quadro de hipertrofia. Estudos futuros poderão validar o papel dessas moléculas como marcadores moleculares e espera-se que os resultados do presente estudo possam direcionar a caracterização de moléculas que auxiliem no prognóstico e tratamento da doença de maneira direcionada, considerando-se a grande variabilidade genética das cepas do T. cruzi.
Análise de QTL e gênomica comparativa para estudar mecanismos regulatórios da H+ -ATPASE de membrana plasmática de Saccharomyces cerevisiae.
(2021) Barbosa, Patrícia Gonçalves Prates; Brandão, Rogélio Lopes; Cunha, Aureliano Claret da; Cruz, Izinara Rosse da; Brandão, Rogélio Lopes; Fietto, Luciano Gomes; Mendes, Tiago Antônio de Oliveira; Andrade, Milton Hércules Guerra de; Silva, Silvana de Queiroz
A H+ -ATPase é uma proteína presente na membrana citoplasmática de plantas e fungos e desempenha um papel essencial na geração de um gradiente eletroquímico de prótons, importante para a captação de nutrientes e regulação do pH intracelular. A ativação da H + -ATPase da membrana citoplasmática em Saccharomyces cerevisiae induzida por glicose é supostamente atribuída a um sinal de cálcio intracelular correlacionado ao metabolismo do fosfatidilinositol. Em estudos anteriores do nosso grupo de pesquisa, foi observada diferença de fenótipo entre as cepas S. cerevisiae BY4742 arg82Δ e PJ69 arg82Δ através do teste de atividade da H + -ATPase, indicando que o fenótipo de maior ativação da H + -ATPase está relacionado a vários genes. Diante do exposto, o objetivo deste trabalho foi utilizar diferentes abordagens genômicas para identificar novos componentes da regulação induzida por glicose da H + -ATPase. Para isso, foram realizados o sequenciamento do genoma segregante agrupado, mapeamento de QTLs e análises de Bioinformática para identificar o possível motivo da diferença de fenótipo e, ou, novos componentes desta via de transdução de sinal. Uma vez identificadas as variantes na análise de mapeamento de QTL foi desenvolvido o script SNPsInQTLselection.py para identificar as bases genéticas que podem estar envolvidas com o fenótipo de maior atividade da H+ -ATPase. Após a utilização desse script foram identificadas 42 variantes em 33 genes potencialmente envolvidos com o fenótipo de interesse. Para priorização desses genes candidatos foi realizado análise de enriquecimento e interatoma que permitiram identificar 10 genes enriquecidos e envolvidos na via da telomerase e do fosfatidilinositol (STT4, PIK2, UGA2, EST1, MEC3, HEK2, TOP3, PSO2, STO1, FUR4). Cepas do background BY contendo essesrespectivos genes deletados (coleção EUROSCARF) foram utilizadas para teste de fenótipo de acidificação extracelular e sinalização de cálcio induzida por glicose. Por meio desses testes, 4 (UGA2, FUR4, EST1 e STT4) dos 10 genes enriquecidos, apresentaram o fenótipo de maior ativação da H+ -ATPase, fenótipo esse evidenciado nos testes de acidificação extracelular e sinal de cálcio. Destes 4 genes, vale destacar o STT4 visto que, de acordo com a função descrita para esse gene na literatura o fosfatidilinositol-4-fosfato pode exercer um papel na regulação da via de ativação de H + -ATPase, controlando a atividade da fosfolipase C. Tendo em vista uma relação positiva entre atividade da H + - ATPase e desempenho fermentativo, estudos futuros podem ser feitos com os genes/alelos identificados neste trabalho, com aplicação em cepas de leveduras industriais visando a melhoria na eficiência de processos fermentativos. Os genes (UGA2, FUR4, EST1 e STT4) merecem investigação detalhada para verificação do possível envolvimento na via de sinalização da H+ -ATPase. Esse trabalho apresenta pela primeira vez uma estratégia de Bioinformática para identificar genes candidatos quando o resultado do mapeamento de QTL não for significativo.
Análise poligênica da tolerância ao alumínio em Saccharomyces cerevisiae por mapeamento de QTL.
(2018) Mezadri, Hygor; Brandão, Rogélio Lopes; Thevelein, Johan; Dumortier, Françoise; Brandão, Rogélio Lopes; Rosa, Carlos Augusto; Tótola, Marcos Rogério; Cota, Renata Guerra de Sá; Freitas, Renata Nascimento de
O bioetanol é um produto de grande importância econômica, principalmente devido a sua utilização como combustível renovável. A levedura Saccharomyces cerevisiae utiliza a sacarose obtida da cana-de-açúcar para produzir bioetanol por fermentação. Alguns fatores diminuem a capacidade fermentativa dessa levedura, por exemplo, a presença de Al3+ no caldo de cana-de-açúcar, levando a um aumento do tempo de fermentação e menor produção de bioetanol. Este trabalho teve como objetivo realizar a análise poligênica da tolerância ao alumínio em Saccharomyces cerevisiae utilizando a técnica de mapeamento de QTLs (Quantitative Trait Locus). Uma triagem entre 840 estirpes de leveduras isoladas de diferentes ambientes foi feita a fim de selecionar uma altamente tolerante ao alumínio. Dentre as estirpes testadas, a levedura denominada Bruggeman Fresh apresentou crescimento e melhor desempenho fermentativo em presença de 5 mM de Al2(SO4)3. A estirpe PE-2, amplamente utilizada na produção de etanol pela indústria brasileira, apresentou uma maior sensibilidade ao alumínio. Estas duas leveduras, Bruggeman Fresh e PE-2, foram escolhidas para a estratégia de análise poligênica para o fenótipo de resistência ao alumínio adotada neste estudo. Após esporulação e dissecação das tétrades, os parentais superior e inferior foram selecionados e cruzados dando origem ao híbrido diploide. Foi realizado um pré-teste em meio sólido contendo alumínio com 658 segregantes obtidos a partir desse híbrido diploide, sendo que 150 segregantes foram selecionados e submetidos ao teste fermentativo. A partir do teste da performance fermentativa em presença de Al2(SO4)3, 30 segregantes foram selecionados como fenótipo superior (alta tolerância ao alumínio). Foi realizada a extração do DNA genômico desses 30 segregantes agrupados e 120 segregantes não selecionados (agrupados randomicamente), assim como das estirpes parentais superior e inferior e sequenciadas. A partir das análises das sequências e mapeamento de QTL foi encontrada uma região no cromossomo VI com grande ligação ao fenótipo de interesse, observado devido à diferença na frequência dos SNPs entre os grupos selecionado e não selecionado. Após a análise de reciprocidade hemizigótica, foi identificado que o gene FAB1 tem um importante papel sobre a tolerância ao alumínio em S. cerevisiae.
Análise proteômica comparativa de amostras de Trypanosoma cruzi pertencentes aos genótipos TcII e TcVI, isoladas de pacientes com doença de Chagas crônica.
(2017) Inácio, Luciana de Jesus; Borges, William de Castro; Lana, Marta de; Oliveira, Maykon Tavares de; Borges, William de Castro; Palmisano, Giuseppe; Veloso, Vanja Maria
O Trypanosoma cruzi é um parasito da ordem Kinetoplastida, agente etiológico da doença de Chagas (DCh), uma enfermidade de evolução crônica progressiva que afeta os sistemas cardiovascular, gastrointestinal e nervoso do hospedeiro humano. Esse protozoário é um parasito intracelular obrigatório que apresenta quatro estágios evolutivos: formas epimastigotas e tripomastigotas metacíclicas no sistema digestivo do inseto vetor; formas amastigotas (intracelulares) e tripomastigotas sanguíneas que parasitam o hospedeiro mamífero. A espécie está subdividida em seis genótipos distintos ou discret typing units (DTUs), nomeados TcI a TcVI, e TcBat. Vários estudos foram conduzidos visando correlacionar a variabilidade genética do T. cruzi com sua biologia e as manifestações clínicas da DCh, e a proteômica representa uma abordagem interessante para estudar mudanças globais na expressão de proteínas entre os diferentes genótipos. O objetivo deste trabalho foi caracterizar alguns parâmetros biológicos por meio de ensaios in vitro e realizar a análise proteômica quantitativa de amostras de T. cruzi pertencentes aos genótipos TcII e TcVI isoladas de pacientes com doença de Chagas crônica, provenientes do Vale do Jequitinhonha, MG. Para este fim, cada amostra de T. cruzi foi cultivada em meio LIT para determinação da curva de crescimento ao longo de 20 dias. A taxa de metaciclogênese foi avaliada em meio Grace. Células “Vero” foram infectadas com tripomastigotas obtidas da diferenciação em meio Grace para avaliar as taxas de infectividade e de multiplicação intracelular de cada amostra nos tempos de 24, 48 e 72 horas de cultivo. Os proteomas das três amostras de epimastigotas de T. cruzi (1107 – TcII, 229 e 2119 – TcVI; em fase exponencial) foram analisados por nano-UHPLC-MS/MS. Para identificação, quantificação label free e comparação das proteínas, foi utilizado o software PEAKS, versão 8, e a categorização das proteínas foi realizada pelo software Blas2GO versão 4.1. Os resultados obtidos revelaram diferenças significativas entre os genótipos TcII e TcVI. A amostra do genótipo TcII apresentou maior área sob a curva na análise do crescimento em meio LIT, enquanto as taxas de metaciclogênese, infectividade e desenvolvimento intracelular foram maiores nas amostras do grupo genético TcVI. A análise proteômica shotgun permitiu a identificação de 3833 proteínas, dentre as quais 212 exibiram expressão diferencial. Dessas proteínas, a maioria encontrava-se com a expressão aumentada nos isolados do genótipo TcVI. Este trabalho permitiu apontar diferenças biológicas e metabólicas importantes entre os isolados investigados e a identificação de possíveis assinaturas proteicas dos genótipos TcII e TcVI.
Análise proteômica da espécie exótica invasora Limnoperna fortunei para fins de prospecção de alvos para o controle e monitoramento.
(2018) Sanson, Ananda Lima; Borges, William de Castro; Borges, William de Castro; Sant'Anna, Eneida Maria Eskinazi; Ruiz, Jeronimo Conceição; Borges, Marcia Helena; Silva, Silvana de Queiroz
A espécie invasora de origem asiática Limnoperna fortunei, conhecida como mexilhão dourado, foi identificada pela primeira vez no Brasil em 1998 no Rio Grande do Sul e, deste então, vem provocando grandes danos econômicos e ambientais, tais como paradas de turbinas em hidrelétricas, entupimento de tubulações, morte de peixes, etc, principalmente por sua capacidade de fixação e proliferação. Neste contexto, o desenvolvimento de métodos capazes de propiciar sua caracterização com vistas ao controle das formas larvais e adultas é de grande interesse econômico, científico e tecnológico. Desde 2014 iniciativas como a elucidação do transcriptoma, genoma mitocondrial e mais recentemente da disponibilidade de dados genômicos dessa espécie tem permitido a aplicação de ferramentas moleculares que permitem estabelecer relações de expressão gênica diferencial frente a exposição a condições ambientais ou agentes diversos. Nesse trabalho, nós reportamos a identificação de 3.233 proteínas de L. fortunei via análise em larga escala (shotgun) empregando-se a cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas (LC-MS/MS). Proteínas de interesse tais como aquelas relacionadas a processos secretórios do parasito bem como vários receptores de membrana representam novos alvos passíveis de intervenção para o controle da espécie. Atenção particular foi dada às subunidades do proteassoma identificadas nesse trabalho. Esse complexo proteolítico é o principal responsável por degradação intracelular de proteínas em eucariotos e constitui alvo interessante para ação de drogas que modulam sua atividade. Neste contexto, o proteassoma 20S de L. fortunei foi obtido em grau satisfatório de homogeneidade e suas atividades peptidásicas avaliadas por meio de peptídeos fluorogênicos. Análises de LC-MS/MS permitiram a identificação de 13 das 14 subunidades que compõem a porção catalítica do proteassoma 20S. Ademais, os dados de proteômica permitiram confirmar a expressão dos principais representantes do sistema proteolítico de degradação intracelular dependente de ubiquitina e proteassoma 26S em L. fortunei. A última abordagem desse trabalho consistiu no bioensaio com a exposição do molusco a diferentes concentrações do moluscicida niclosamida (0,25 a 8,0 mg.L-1) para avaliação das alterações proteômicas induzidas. Ao todo, 46 proteínas diferencialmente expressas entre os indivíduos dos grupos controle e teste foram apontadas. Os resultados obtidos com esta abordagem constituem o primeiro inventário do proteoma expresso da espécie invasora L. fortunei e podem contribuir com a proposição racional de novos alvos moleculares para programas de controle e monitoramento desse bioinvasor.
Análise proteômica do secretoma de Leishmania infantum e ensaios preliminares para a descoberta de biomarcadores da Leishmaniose visceral canina.
(Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós Graduação, Universidade Federal de Ouro Preto., 2012) Soares, Micheline; Borges, William de Castro
As leishmanioses constituem um grupo heterogêneo de doenças que abrangem áreas tropicais e subtropicais, sendo endêmicas em 88 países com aproximadamente 12 milhões de infectados e 350 milhões de pessoas expostas ao risco. Por ano, cerca de 1.500.000 casos de leishmaniose tegumentar e 500.000 casos de leishmaniose visceral (LV) são relatados. Os cães, os principais reservatórios domésticos, são considerados o principal elo na cadeia de transmissão da LV. A partir da disponibilidade dos dados de sequenciamento dos genomas de algumas espécies de Leishmania (L. major, L. infantum e L. braziliensis), ferramentas na área da proteômica podem ser empregadas para a identificação de novas proteínas com potencial para o diagnóstico, prognóstico e/ou o desenvolvimento de vacinas contra a leishmaniose. O foco do presente estudo constituiu a caracterização molecular do secretoma da espécie L. infantum, utilizando-se de uma abordagem proteômica. Promastigotas em fase log de crescimento foram submetidos ao cultivo sob duas condições experimentais. A primeira, nas condições normais de cultivo de promastigotas (pH 7.2 e temperatura de 26ºC) e, para a segunda, utilizando condições para mimetizar o microambiente de um fagolisossomo (pH 5.5 e temperatura de 35ºC). A homogeneidade do secretoma foi avaliada a partir da contagem de parasitos viáveis, durante diferentes tempos de cultivo, empregando marcação por iodeto de propídeo e citometria de fluxo. A técnica de marcação revelou que durante 8h de cultivo a percentagem de parasitos viáveis manteve-se aproximadamente 94%. A fração do sobrenadante de cultura, obtido durante 6h em pH 7.2, foi submetida à digestão em solução utilizando tripsina. Os peptídeos resultantes foram separados usando cromatografia de fase reversa e detectados para fragmentação a partir de uma interface acoplada ao espectrômetro de massas operando via electrospray. Após busca de homologia em bancos de dados foram identificadas 135 proteínas, as quais foram classificadas em 9 categorias funcionais e 1 hipotética. Dados sobre abundância relativa permitiram concluir que o secretoma de L. infantum está representado por basicamente três categorias (1) metabolismo de nucleotídeos, (2) metabolismo de carboidratos e (3) outros processos. Sessente e três proteínas foram submetidas à análises de bioinformática para predição de sinais moleculares indicativos de secreção, por meio de vias clássicas e não clássicas. Cerca de 50% das proteínas investigadas são potencialmente secretadas, das quais, 30% atingem o meio extracelular por vias não clássicas. Soros de animais naturalmente infectados, portadores de diferentes formas clínicas da LVC, foram utilizados para testar a imunogenicidade associada aos secretomas de L. infantum e L. amazonensis. Experimentos de Western blotting mostraram que ambas as preparações são úteis na identificação de animais portadores de LVC. Além disso, as mesmas frações podem ser utilizadas na discriminação de animais sintomáticos, daqueles portadores de outras formas clínicas da doença. Coletivamente, a caracterização molecular do secretoma de L. infantum e os ensaios preliminares de imunoproteômica abriram novas possibilidades de investigação relacionadas ao tratamento, prognóstico e diagnóstico da LVC.
Análise proteômica dos alvos ligantes de niclosamida em extrato solúvel de Limnoperna fortunei Dunker, 1857.
(2023) Nilsen, Luis Henrique Flores; Borges, William de Castro; Andrade, Milton Hércules Guerra de; Borges, William de Castro; Sanson, Ananda Lima; Cabral, Fernanda Janku
A espécie Limnoperna fortunei (Dunker, 1857), é um molusco bivalve, conhecido popularmente como mexilhão dourado o qual representa atualmente um sério problema ambiental e econômico. Este trabalho teve como objetivo a caracterização do proteoma solúvel de L. fortunei por meio de cromatografia de afinidade com imobilizante niclosamida para a prospecção de possíveis alvos ligantes desse moluscicida. Para este fim, a niclosamida foi reconstruída no adsorvente em resina de Sepharose 4B. O extrato total do mexilhão dourado, L. fortunei, foi aplicado à coluna de afinidade e após lavagens sucessivas da coluna, as proteínas ligantes foram eluídas com niclosamida/DMSO. Em seguida, procedeu-se com a identificação em larga escala das proteínas eluídas por meio de cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas (LC-MS/MS). A interrogação dos dados espectrais, contra o proteoma predito de L. fortunei, permitiu a identificação de 221 grupos de proteínas. A anotação das proteínas identificadas foi realizada por meio de busca de similaridade, utilizando o algoritmo BLASTp. Dentre as proteínas identificadas destacam-se aquelas pertencentes ao citoesqueleto, como actina beta 1, tubulinas (isoformas alfa e beta), além de proteínas relacionadas ao estresse e imunidade tais como proteínas de choque térmico, sendo elas: HSP90, HSP70 e HSP20 e calreticulin. Os resultados obtidos permitiram agregar conhecimento molecular ao mecanismo de ação da niclosamida bem como apontar novas possibilidades para intervenção no controle da proliferação deste molusco invasor.
Análises de QTL e genômica comparativa para estudar mecanismos regulatórios da H+-ATPase de membrana.
(2021) Barbosa, Patrícia Gonçalves Prates; Brandão, Rogélio Lopes; Cunha, Aureliano Claret da; Cruz, Izinara Rosse da; Brandão, Rogélio Lopes; Fietto, Luciano Gomes; Mendes, Tiago Antônio de Oliveira; Andrade, Milton Hércules Guerra de; Silva, Silvana de Queiroz
A H+ -ATPase é uma proteína presente na membrana citoplasmática de plantas e fungos e desempenha um papel essencial na geração de um gradiente eletroquímico de prótons, importante para a captação de nutrientes e regulação do pH intracelular. A ativação da H + -ATPase da membrana citoplasmática em Saccharomyces cerevisiae induzida por glicose é supostamente atribuída a um sinal de cálcio intracelular correlacionado ao metabolismo do fosfatidilinositol. Em estudos anteriores do nosso grupo de pesquisa, foi observada diferença de fenótipo entre as cepas S. cerevisiae BY4742 arg82Δ e PJ69 arg82Δ através do teste de atividade da H + -ATPase, indicando que o fenótipo de maior ativação da H + -ATPase está relacionado a vários genes. Diante do exposto, o objetivo deste trabalho foi utilizar diferentes abordagens genômicas para identificar novos componentes da regulação induzida por glicose da H + -ATPase. Para isso, foram realizados o sequenciamento do genoma segregante agrupado, mapeamento de QTLs e análises de Bioinformática para identificar o possível motivo da diferença de fenótipo e, ou, novos componentes desta via de transdução de sinal. Uma vez identificadas as variantes na análise de mapeamento de QTL foi desenvolvido o script SNPsInQTLselection.py para identificar as bases genéticas que podem estar envolvidas com o fenótipo de maior atividade da H+ -ATPase. Após a utilização desse script foram identificadas 42 variantes em 33 genes potencialmente envolvidos com o fenótipo de interesse. Para priorização desses genes candidatos foi realizado análise de enriquecimento e interatoma que permitiram identificar 10 genes enriquecidos e envolvidos na via da telomerase e do fosfatidilinositol (STT4, PIK2, UGA2, EST1, MEC3, HEK2, TOP3, PSO2, STO1, FUR4). Cepas do background BY contendo essesrespectivos genes deletados (coleção EUROSCARF) foram utilizadas para teste de fenótipo de acidificação extracelular e sinalização de cálcio induzida por glicose. Por meio desses testes, 4 (UGA2, FUR4, EST1 e STT4) dos 10 genes enriquecidos, apresentaram o fenótipo de maior ativação da H+ -ATPase, fenótipo esse evidenciado nos testes de acidificação extracelular e sinal de cálcio. Destes 4 genes, vale destacar o STT4 visto que, de acordo com a função descrita para esse gene na literatura o fosfatidilinositol-4-fosfato pode exercer um papel na regulação da via de ativação de H + -ATPase, controlando a atividade da fosfolipase C. Tendo em vista uma relação positiva entre atividade da H + - ATPase e desempenho fermentativo, estudos futuros podem ser feitos com os genes/alelos identificados neste trabalho, com aplicação em cepas de leveduras industriais 8 visando a melhoria na eficiência de processos fermentativos. Os genes (UGA2, FUR4, EST1 e STT4) merecem investigação detalhada para verificação do possível envolvimento na via de sinalização da H+ -ATPase. Esse trabalho apresenta pela primeira vez uma estratégia de Bioinformática para identificar genes candidatos quando o resultado do mapeamento de QTL não for significativo.
Análises genômicas para otimização da produção de compostos aromatizantes por estirpe de Saccharomyces cerevisiae isolada de produção de cachaça.
(2018) Araújo, Thalita Macedo; Brandão, Rogélio Lopes; Diniz, Raphael Hermano Santos; Mendes, Tiago Antônio de Oliveira; Borges, William de Castro; Fietto, Luciano Gomes; Brandão, Rogélio Lopes; Andrade, Milton Hércules Guerra de
A qualidade das bebidas alcoólicas está intimamente relacionada à presença de concentrações equilibradas de compostos voláteis, subprodutos do processo de fermentação alcoólica e altamente influenciados pela linhagem da levedura utilizada de tal modo que a compreensão das bases moleculares da produção de compostos desejáveis represente a possibilidade do incremento da qualidade de bebidas fermentadas visando a agregação de valor ao produto final. O presente trabalho tem como objetivo realizar uma análise de características genéticas e fisiológicas das leveduras isoladas da produção de cachaça com potencial para aplicação na produção de outras bebidas alcoólicas. Desse modo, 118 linhagens da coleção LBCM foram avaliadas quanto a capacidade de metabolização de maltose, produção de baixas concentrações de sulfeto de hidrogênio, capacidade de transporte de maltotriose e capacidade de produção de compostos voláteis. A despeito de sua origem comum, as leveduras avaliadas apresentaram diferenças significativas em sua fisiologia. Algumas dessas leveduras apresentam potencial biológico para aplicação na produção de outras bebidas, como, por exemplo, cerveja. A linhagem LBCM1073 foi selecionada dentre as demais por ser heterotálica e pela sua capacidade de produção de acetato de isoamila, um éster altamente desejável em diversas bebidas alcoólicas. Após sequenciamento genômico dessa levedura, com cobertura de 263 vezes e a predição de 5686 genes, análises de genômica comparativa revelaram que a linhagem LBCM1073 apresenta um conjunto de 24 genes ausentes na linhagem laboratorial S. cerevisiae S288c. Alguns desses genes apresentam similaridade com S. bayanus e Lachancea sp. Um total de 64,15% dos genes da linhagem LBCM1073 apresenta ortólogos com genes de 40 ascomicetos avaliados. Dentre as vias já mencionadas na literatura como relacionadas à produção de compostos voláteis, a via de sinalização mTOR e a glicólise, são as que apresentaram maior percentual de genes ortólogos, justificado pela ampla distribuição dessas duas vias dentre os organismos utilizados para análise. Ao serem comparadas as sequências de aminoácidos de 34 enzimas,relacionadas à produção de compostos responsáveis por aromas, 13 foram idênticas entre LBCM1073 e S. cerevisiae S288c. Para as demais, as proteínas codificadas por LEU4, PMA1, RSP5, TOR1 e FAS2 não apresentaram as substituições descritas na literatura como relacionadas à maior produção de compostos on flavour. Em conjunto, esses dados mostram que LBCM1073 e S. cerevisiae S288c apresentam diversas distinções a nível genômico. Uma metodologia capaz de contribuir para melhor elucidar essas diferenças em relação à produção de compostos secundários à fermentação é a técnica de BSA (Bulked Segregants Analisys) ou análise de agrupamentos de segregantes. As análises fenotípicas de segregantes obtidos do cruzamento entre LBCM1073 e S. cerevisiae S288c revelou uma discreta relação direta entre a capacidade de conversão de álcool isoamílico em acetato de isoamila e o crescimento na presença de TFL 0,5 mM. Além disso, os segregantes já obtidos e avaliados poderão ser empregados na análise de QTLs envolvidos na produção de acetato de isoamila.
Associação de métodos espectrofotométricos e eletroanalítico para avaliação do potencial antioxidante de isobenzofuran-1(3H)-onas sobre culturas primárias de neurônios hipocampais.
(2020) Teixeira, Aniely dos Reis; Nogueira, Katiane de Oliveira Pinto Coelho; Oliveira, Laser Antônio Machado de; Nogueira, Katiane de Oliveira Pinto Coelho; Santos, Orlando David Henrique dos; Sartori, Sirlene Souza Rodrigues
O sistema nervoso central, principal sistema de regulação das atividades fisiológicas, pode ser fortemente acometido por processos patológicos gerados pelo desequilíbrio redox que culminam no desenvolvimento de doenças neurodegenerativas. Dentre essas, a mais prevalente, a doença de Alzheimer, acomete um grande número de pessoas impactando fortemente nos recursos públicos destinados à saúde. O desequilíbrio redox gera acúmulo de espécies reativas de oxigênio (EROs), que interferem diretamente na viabilidade das células nervosas. Estudos do nosso grupo de pesquisa mostraram que uma classe de compostos conhecidos como isobenzofuran-1-(3H)-onas (F12) apresentam ação antioxidante capaz de reduzir os danos ocasionados pelo desequilíbrio redox induzido. Neste trabalho avaliamos o efeito antioxidante de isobenzofuran-1-(3H)-onas sintéticas estruturalmente semelhantes (F15 e F16) sobre culturas primárias de neurônios do hipocampo obtidos de embriões E17 de camundongos C57BL/6, assim como seus potenciais de oxidação através da voltametria cíclica (VC). Para isto as culturas foram pré-tratadas com diferentes concentrações de isobenzofuran-1-(3H)-onas e submetidas ao desequilíbrio redox utilizando o peróxido de hidrogênio. Após a indução foram realizados ensaios de viabilidade celular, mensuração de EROs e peroxidação lipídica das membranas para avaliar a ação dos compostos sobre a cultura primária de neurônios hipocampais. De forma a complementar e confirmar os ensaios espectrofotométricos foi realizada a VC, método eletroanalítico para determinação do potencial de oxidação (Eo) e consequentemente a capacidade antioxidante. O composto F15 foi capaz de reduzir as EROs e os danos causados aos lipídeos da membrana. Os resultados dos ensaios espectrofotométricos foram corroborados pela VC que permitiram caracterizar o composto F15 como potencial antioxidante. Assim, outros estudos devem ser realizados para melhor caracterizar a ação antioxidante desses compostos e torná-los possíveis candidatos a fármacos para uso na terapia de doenças neurodegenerativas.
Atividade anti-angiogênica de inibidores de tripsina em membrana corioalantóica de Gallus domesticus.
(Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós Graduação, Universidade Federal de Ouro Preto., 2013) Ferreira, Cyntia Silva; Andrade, Milton Hércules Guerra de
Os inibidores do tipo Bowman-Birk (BBI) são proteínas contendo dois domínios inibitórios distintos para enzimas tripsina- e quimotripsina-símile. Muitos trabalhos mostram o uso desses inibidores como agentes anti-cancerígenos, no entanto, estudos prévios do nosso laboratório revelaram uma biodistribuição limitada do BBI. Peptídeos sintéticos análogos aos domínios inibitórios do BBI também apresentaram baixa biodisponibilidade, possivelmente devido à degradação. Com o objetivo de construir inibidores mais estáveis foram adicionados motivos do tipo dedo de zinco – sequências de aminoácidos com reconhecida função estabilizadora. Esses inibidores (CPI- e HPI-trip, para tripsina e CPI- e HPI-quimo, para quimotripsina) foram comparados ao inibidor nativo e às suas respectivas alças de inibição YCT-trip e YCA-quimo. A estabilidade dessas espécies químicas foi testada do ponto de vista térmico, redutor e de resistência à hidrólise. Os peptídeos sintéticos contendo dedo de zinco mostraram comportamento similar aos inibidores convencionais. A atividade biológica dos inibidores foi avaliada no complexo proteolítico proteassoma 20S de Ratos Wistar e em membrana corioalantóica de Gallus gallus domesticus. Os inibidores de quimotripsina apresentaram atividade inibitória sobre o proteassoma 20S, mas não geraram alterações na membrana corioalantóica. Da mesma forma, os análogos contendo o motivo dedo de zinco apresentaram baixa atividade tanto no proteassoma quanto na membrana. Por outro lado, os inibidores de tripsina apresentaram atividade inibitória sobre o proteassoma e produziram respostas anti-angiogênicas na concentração de 100 nM, de maneira relacionada à atividade da pentamidina, – uma droga com elevada atividade anti-tripsina. Ao contrário da pentamidina, o inibidor Bowman-Birk é considerado isento de toxicidade em humanos, colocando essa classe de inibidores como potenciais drogas anti-angiogênicas.
Atividade antiangiogênica de inibidores de tripsina.
(2015) Vieira, André Francisco de Castro; Andrade, Milton Hércules Guerra de; Andrade, Milton Hércules Guerra de; Castro, Ieso de Miranda; Cardoso, Leonardo Máximo
Os inibidores Bowman-Birk, comumente chamados de BBI, são moléculas proteicas caracterizadas pela presença de dois domínios independentes, capazes de inibir serino-proteases. Embora os mecanismos de atividade biológica dessas moléculas não estejam totalmente elucidados, o interesse por essa classe de inibidores está relacionado com a descoberta de que o BBI pode atuar como agente preventivo do câncer. A capacidade do BBI de prevenir a carcinogênese tem sido estudada extensivamente, tanto em sua forma purificada quanto na forma de extrato proteico de soja enriquecido de BBI, chamado de BBI concentrado (BBIC). Parte do efeito antitumoral pode estar relacionada a uma possível atividade anti-angiogênica, uma vez que proteases que degradam a matriz extracelular podem ter atividade reduzida na presença de inibidores de tripsina. Esse trabalho teve como proposta a avaliação da atividade anti-angiogênica de inibidores de tripsina e domínios sintéticos relacionados ao BBI. Nesse sentido foram avaliados os peptídeos inibidores de tripsina e quimotripsina, sintetizados pelo nosso grupo de pesquisa utilizando-se o protocolo de síntese em fase sólida estabelecido por Merrifield (1963), o BBI purificado através de cromatografia de troca iônica, o inibidor de semente de abóbora CMTI purificado pelo método de cromatografia de afinidade e pentamidina. O inibidor BBI quando purificado em cromatografia de troca iônica demonstrou alta capacidade anti-angiogênica nas doses de 7000 até 70 pmols, enquanto quando purificado em cromatografia de afinidade ocorre à perda de praticamente toda sua atividade antitripsina e antiangiogênica, demonstrando a importância da integridade desse domínio na atividade. Os peptídeos sintéticos também foram ativos entre as doses de 7000 a 700 pmols, sendo a maior atividade observada para o peptídeo inibidor de tripsina. O inibidor de abórora purificado em cromatografia de afinidade também apresentou resposta anti-angiogênica nas concentrações de 7000 a 700 pmols em intensidade semelhante ao inibidor de tripsina sintético. A atividade ani-angiogênica associada à inibição de tripsina promovida pelos inibidores naturais e análogos gerou uma resposta máxima de 40% de redução da angiogênese. Entretanto, a pentamidina apresentou-se ativa entre doses de 7000 a 7 pmols com uma redução de até 80% na angiogênese, possivelmente, pelo fato de apresentar uma atividade antiproliferativa além da inibição de proteases. Esses resultados reforçam as evidências que inibidores de tripsina são dotados de atividade anti-angiogênica e que inibidores proteicos com propriedades antitumorais, como o BBI, podem exercer em parte, sua ação mediante a inibição da angiogênese.
Atividade cicatrizante de peptídeos sintéticos ricos em prolina e argina em modelo de escisão cutânea do dorso de Mus musculus swiss.
(2018) Fernandes, Arádia Gonzales de Oliveira; Andrade, Milton Hércules Guerra de; Babá, Élio Hideo; Cardoso, Leonardo Máximo; Andrade, Milton Hércules Guerra de
A pele é o maior órgão do corpo humano e possui funções cruciais na manutenção da homeostase assim como na saúde geral. As feridas são o resultado de lesões na pele e podem ser causadas por queimaduras, insetos, agentes microbianos, diabetes, isquemia e trauma. A cura de feridas é um processo essencial para reestabelecer a barreira protetora que defende o corpo do ambiente. Tipicamente, a cicatrização aguda de feridas é um processo bem organizado que leva a um reparo tecidual previsível, com plaquetas, queratinócitos, células imunológicas, células microvasculares e fibroblastos desempenhando papéis importantes na restauração da integridade tecidual. A cicatrização é um processo evolutivo conservado entre as espécies e abrange processos distintos, entretanto sobrepostos espacialmente e temporalmente que incluem a hemostasia/coagulação, inflamação, proliferação celular/reepitelização e a remodelação da matriz extracelular. Proteínas possuem um papel fundamental em todos os processos biológicos, sendo o equilíbrio finamente regulado entre a síntese e degradação fator decisivo na homeostase celular. O peptídeo natural da família das cateciclinas PR-39 (RRRPRPPYLPRPRPPPFFPPRLPPRIPPGFPPRFPPRFP) é um peptídeo natural rico em prolina e arginina secretado por macrófagos que teve sua capacidade de inibir a atividade catalítica do proteassoma 20S demonstrada assim como capacidade anti-inflamatória, através da inibição da degradação de fatores IκB, e angiogênica pela inibição da degradação de HIF-1α. Em estudos anteriores, foi demonstrado uma atividade inibitória sobre o proteassoma assim como uma atividade angiogênica de análogos ao PR-39. A análise do resultados da área da ferida, demonstra aumento da velocidade cicatrizante para o PR-11 e F-12 no décimo dia na concentração de 10-5 M, e no sétimo e décimo dia nas concentrações de 10-4 M e 10-3 M. O Bephantol® a 10-4 M, um cicatrizante clássico com dexpantenol (pré-vitamina B5), foi utilizado como controle positivo. Este apresenta aumento da velocidade de fechamento da ferida apenas no décimo dia de tratamento. Os análogos PR-11 e F12 apresentaram uma presença inferior de exudado indicativo de infecção na concentração avaliada de 10-4 M a partir do sétimo dia e o controle positivo com Bephantol® 10-4 M apresentou essa atividade apenas no décimo dia de tratamento. Esses resultados indicam a atividade antimicrobiana apresentada pelos análogos. Assim, a capacidade de aumento na velocidade de cicatrização da ferida assim como a diminuição da infecção das mesmas, torna os análogos PR-11 e F-12 ótimos candidatos a criação de formulação para utilização como cicatrizante.
Atividade citotóxica de fungos endofíticos associados à Clusia arrudae Planchon & Triana (Clusiaceae).
(Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós Graduação, Universidade Federal de Ouro Preto., 2012) Silva Filho, Antonio Cesar Corrêa; Rosa, Luiz Henrique
Os fungos são organismos capazes de sobreviver isoladamente ou em relações simbióticas com outros organismos. Nos tecidos vegetais os fungos colonizam espaços intracelulares de plantas sem causar dano aparente ao seu hospedeiro, os quais são chamados de endofíticos e por colonizar estes espaços e apresentar constante interação com seu hospedeiro, estes fungos são capazes de produzir diferentes metabólitos bioativos. O câncer, ainda hoje, é uma doença que acomete milhares de pessoas ao redor do mundo. A busca por novos compostos com atividade antitumoral, principalmente oriundos direta ou indiretamente de vegetais, são importantes para obtenção de tratamentos mais eficazes e com menos efeitos colaterais. Neste estudo, 30 exemplares de Clusia arrudae Planchon & Triana tiveram suas folhas e caules coletados e inoculados em placas de Petri contendo meio Agar Dextrosado Batata (BDA) para isolamento dos seus fungos endofíticos associados. Um total de 100 isolados de fungos, agrupados em 21 morfotipos, foram obtidos; destes 63 do caule e 37 das folhas. Os fungos obtidos foram submetidos à extração etanólica de seus metabólitos, os quais foram avaliados quanto à capacidade de inibir as linhagens tumorais humanas HUTU (HTB-40) e RKO (CRL-2579), bem como uma linhagem humana normal WI26VA4 (CCL-951). As linhagens celulares foram expostas aos extratos dos 41 fungos endofíticos nas concentrações de 240, 120, 60 e 30 μg/mL (p/v) e tiveram sua morfologia analisada por microscopia utilizando sondas fluorescentes para identificação do núcleo, citoesqueleto e viabilidade celular. Os ensaios de citotoxicidade, considerando a Concentração Inibitória (CI50), demonstraram que oito extratos apresentaram atividade sobre as linhagens celulares analisadas; ao ampliar a linha de corte para CI55, quatro extratos apresentaram tendência à toxicidade. Os fungos produtores de extratos bioativos foram identificados por meio do sequenciamento da região ITS do rDNA gene. Os extratos dos fungos Pleosporales sp. UFMGCB 5502, Pleosporales sp. UFMGCB 5467, Pleosporales sp. UFMGCB 5485, Xylaria sp. UFMGCB 5500 e Pleosporales sp. UFMGCB 5498. apresentaram toxicidade sobre a linhagem normal de pulmão WI26VA4. Dos extratos que apresentaram toxicidade, apenas o extrato do fungo Pleosporales sp. UFMGCB 5502 também apresentou atividade antitumoral para a HUTU, juntamente com Pleosporales sp. UFMGCB 5478 e Pleosporales sp. UFMGCB 5533. Para linhagem RKO, somente o extrato do fungo Pleosporales sp. UFMGCB5460 exerceu citoxicidade. Considerando o valor de CI55, os fungos UFMGCB 5534, UFMGCB 5539, UFMGCB 5508 UFMGCB 5489 mostraram toxicidade para todas as linhagens. Os fungos que causam citoxicidade para a célula RKO foram predominantemente isolados dos caules e para a célula HUTU das folhas, independente do morfotipo encontrado. Os fungos obtidos das folhas causaram quebra do citoesqueleto e as células permaneceram vivas quando analisadas pelo kit de viabilidade celular. Já os fungos obtidos do caule causaram aglutinação e perda de adesão celular e indicio de morte. A partir destes resultados podemos concluir que a comunidade de fungos endofíticos associados a C. arrudae são capazes de produzir metabólitos com atividade citotóxica em linhagens tumorais humanas in vitro e alguns extratos também se mostraram tóxicos para células normais.
Atividade herbicida de fungos fitopatogênicos associados a plantas do fragmento de Mata Atlântica do Parque Estadual do Rio Doce, Minas Gerais, Brasil.
(2020) Barreto, Debora Luiza Costa; Rosa, Luiz Henrique; Carvalho, Camila Rodrigues de; Rosa, Luiz Henrique; Carvalho, Camila Rodrigues de; Santiago, Iara Furtado; Ferreira, Mariana Costa
Com o aumento da população mundial e, consequentemente, o aumento da demanda por alimentos, as produções agrícolas vêm sendo sobrecarregadas em todo o mundo. As ervas daninhas são responsáveis por 60% das perdas nas plantações, tornando a agricultura dependente dos controles químicos. No entanto, com o uso indiscriminado, repetitivo e contínuo dos herbicidas, o número de plantas daninhas resistentes tem aumentado. Atualmente, existem vários tipos de herbicida disponíveis no mercado, mas todos eles possuem os mesmos mecanismos de ação dos lançados há 30 anos, o que justifica a resistência adquirida e leva os agricultores a aumentar a taxa de aplicação, colocando em risco à saúde humana e do meio ambiente. Pesquisas recentes demonstram que os metabólitos secundários produzidos por fungos são bastante promissores para o desenvolvimento de herbicidas naturais, pois exibem atividade em baixas concentrações, além de serem considerados mais seguros que os sintéticos. Os fungos fitopatogênicos, aqueles que causam doenças em plantas, vêm se destacando como produtores de substâncias herbicidas para uso na agricultura. Com isto, o presente estudo teve como objetivo isolar fungos fitopatogênicos a partir de lesões foliares de plantas com sinais de infecção coletadas no Parque Estadual do Rio Doce (PERD), Minas Gerais, Brasil, avaliar a atividade herbicida e identificar os isolados fúngicos bioativos. A partir de 27 plantas amostradas foram isolados 308 fungos. Extratos diclorometânicos foram produzidos a partir de todos os isolados, os quais foram testados na concentração de 1 mg/mL frente a sementes dos modelos de monocolitedônea (Allium schoenoprasum - cebolinha) e dicotiledônea (Lactuca sativa - alface crespa), a fim de avaliar seu potencial herbicida. Quinze fungos foram considerados ativos no ensaio, nove positivos frente a L. sativa, três frente a A. schoenoprasum e três para ambos os modelos. Três fungos apresentaram resultados significativos e se destacaram por inibir a germinação de todas as sementes de pelo menos um modelo alvo em baixas concentrações. Diaporthe sp. 2 UFMGCB17744 foi ativo na concentração de 125 µg/mL para o modelo de monocotiledônea, Diaporthe sp. 4 UFMGCB17905 e Xylaria sp. 2 UFMGCB17649 foram ativos na concentração de 500 µg/mL para o modelo de monocotiledônea e 250 µg/mL para o modelo de dicotiledônea, respectivamente. Os extratos de Diaporthe sp. 2 UFMGCB17744, Diaporthe sp. 4 UFMGCB17905 e Xylaria sp. 2 UFMGCB17649 foram fracionados em cartucho C18 e as frações obtidas foram testadas no ensaio herbicida, demonstrando que foi possível separar as substâncias que possuíam atividade, pois apenas algumas frações tiveram resultado positivo no ensaio. Os resultados obtidos nesse trabalho demonstram que os fungos fitopatogênicos residentes em plantas da Mata Atlântica possuem a capacidade de produzirem metabólitos secundários com atividade herbicida, além da importância de se explorar tais metabólitos considerando serem fontes úteis para a descoberta de novos mecanismos de ação que podem ser utilizados para a formulação de herbicidas naturais.