PPBIOTEC - Programa de Pós-graduação em Biotecnologia
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Resultados da Pesquisa
Item Desenvolvimento de biossensor para detecção direta de Flavivirus utilizando nanobastões de ouro.(2019) Ribeiro, Erica Milena de Castro; Silva, Breno de Mello; Silva, Breno de Mello; Tótola, Antônio Helvécio; Figueiredo, Rute Cunha; Paula, Sérgio Oliveira de; Mosqueira, Vanessa Carla FurtadoA co-circulação de Dengue virus, Zika virus, Yellow fever virus, Chikungunia virus e Mayaro virus tem causado grande impacto na saúde pública brasileira e mundial. Os programas de controle e prevenção de arboviroses e estudos epidemiológicos poderiam ser muito beneficiados e aperfeiçoados com a utilização de metodologias de detecção direta dos vírus em mosquitos, pois possibilitaria uma vigilância mais precisa nas populações de vetores ao longo do tempo. Porém, os métodos de diagnósticos hoje disponíveis, apesar de possuírem alta sensibilidade e especificidade são, em sua maioria, onerosos, demandam treinamento específico para aplicação e interpretação e não provem um diagnóstico rápido. Neste contexto, o desenvolvimento de novas tecnologias de biossensores que apresentem benefícios quanto ao tempo de análise, sensibilidade e simplicidade de manipulação têm sido objeto de pesquisa nas esferas pública e privada. A partir deste fato, este trabalho propõe desenvolver e analisar a eficácia de metodologias de funcionalização de nanobastões de ouro (NBs) com anticorpos específicos anti-DENV2 e anti-flavivirus para testar a capacidade de detecção de ligação anticorpo-partícula viral. A detecção de biomoléculas ligadas às nanopartículas de ouro (AuNPs), tais como proteínas e anticorpos, pode ser feita a partir da análise do seu espectro de absorção. Para isso, nanobastões de ouro foram sintetizados, funcionalizados a 4 mM de polietilenoimina, conjugados a 0,4 μg/mL de anticorpos e incubados com 103 UFP/mL de vírus. Os dados foram obtidos através da leitura da ressonância plasmônica de superfície localizada em espectrômetro de varredura UV-Vis. A síntese dos nanobastões, que utilizou o método de crescimento com sementes com a utilização de diferentes agentes redutores, mostrou-se reprodutível. Além disso, um deslocamento muito expressivo no pico de absorção foi observado quando biossensores contendo anti-flavivirus foram incubados em solução com DENV2 e ZIKV, mas não foi observado após incubação com MAYV, um Alphavirus utilizado como controle negativo. Como esperado, nos biossensores contendo anti-DENV2 o deslocamento foi observado apenas na presença de DENV2, demonstrando a especificidade dos anticorpos utilizados. Na presença de soro humano diluído 1:3200 e macerado de mosquito diluído 8x, contendo DENV2 ou ZIKV, o limite de detecção estimado foi de 100 UFP/mL. Assim, sugere-se que os nanobastões de ouro apresentam potencial para o desenvolvimento de novas metodologias de diagnóstico mais rápidos, precisos e práticos que as técnicas já existentes e viabilizar estudos de vigilância da virologia em mosquitos.Item Funcionalização de nanobastões de ouro para diagnóstico da paracoccidioidomicose.(2017) Ferreira, Cyntia Silva; Silva, Breno de Mello; Silva, Breno de Mello; Carvalho, Andréa Teixeira de; Sousa, Edésia Martins Barros de; Santos, Orlando David Henrique dos; Cota, Renata Guerra de SáA paracoccidioidomicose (PCM) é uma micose granulomatosa sistêmica causada por duas espécies de um fungo termodimórfico: Paracoccidioides brasiliensis e Paracoccidioides lutzii. A doença é endêmica na América Latina e está associada a fatores sociais e econômicos. Embora a maioria das formas clínicas seja assintomática, podem ocorrer infecções severas e progressivas, envolvendo o tecido pulmonar e até mesmo o sistema nervoso central. Desse modo, sem uma intervenção terapêutica específica, o quadro da maioria dos pacientes acaba evoluindo para o óbito. Apesar da relevância da doença, não existe ainda um diagnóstico rápido e preciso com custo apropriado para as áreas endêmicas. Nesse sentido, uma alternativa é representada pelo uso de nanobastões de ouro (AuNBs), os quais possuem uma forte absorção característica no espectro visível (ressonância de plasmon) que pode ser monitorada por espectrofotometria. Considerando o uso dos AuNBs como biosensores, os mesmos foram funcionalizados com ácido lipóico ou polietilenoimina (ligantes contendo grupos carboxílicos ou aminas livres que permitem a ligação com proteínas antigênicas ou imunoglobulinas, respectivamente). Tais conjugados foram testados na presença dos alvos purificados e também desafiados com soro de pacientes saudáveis e com paracoccidioidomicose comprovada, e soro de camundongos infectados. A ligação efetiva das biomoléculas em questão foi observada através do deslocamento do pico de absorção plasmônica longitudinal dos AuNBs, sendo satisfatórias quando empregadas as biomoléculas purificadas e quando desafiados com soro de camundongos infectados, para a detecção de antígenos. Esses resultados mostram que o sistema deve ser aprimorado para a detecção tanto de antígenos como de anticorpos em soro humano. O deslocamento observado para as biomoléculas purificadas e com o soro de camundongos pode justificar em parte, o sucesso do sistema de detecção proposto, já destacado pela literatura com outros tipos de biomoléculas, e coloca os AuNBs funcionalizados obtidos nesse trabalho como biosensores úteis para o estudo e desenvolvimento de novas abordagens de diagnóstico para a paracoccidioidomicose. Além disso, representa um avanço biotecnológico para o diagnóstico de doenças negligenciadas.Item Produção e análise de partículas sub-micrométricas poliméricas em modelo murino com potencial aplicação em vacinas anti-Leishmania.(2014) Silva, João Guilherme Lino da; Giunchetti, Rodolfo Cordeiro; Mosqueira, Vanessa Carla Furtado; Giunchetti, Rodolfo Cordeiro; Luca, Paula Mello de; Silva, André Talvani Pedrosa daA leishmaniose visceral é causada pela Leishmania chagasi (sinonímia Leishmania infantum) e para se evitar a transmissão da doença, o desenvolvimento da vacina anti-leishmaniose visceral canina (LVC) é considerada a principal estratégia racional. Neste contexto, diferentes estudos propõem que seria possível um incremento na imunogenicidade vacinal anti-Leishmania ao se realizar o encapsulamento do antígeno. O objetivo deste estudo foi produzir partículas sub-micrométricas (SMP), com potencial para encapsular antígenos candidatos contra Leishmania em modelo murino e analisar o perfil inflamatório e toxicidade. Neste contexto foi realizada a produção de partículas a partir da reação entre a fase oleosa, contendo diferentes concentrações de Ácido Polilático (PLA) e acetona, e a fase aquosa, contendo diferentes concentrações de quitosana, antígeno de Leishmania braziliensis e água. Após evaporação do solvente, o tamanho das partículas foi analisado por espectroscopia de correlação de fótons, após diluição das amostras em água ultra-pura. O tamanho das SMPs obtidas variou entre 200nm e 1200μm, demonstrando variação dependente da concentração dos constituintes utilizados. Além disso, foi obtido potencial zeta variando entre +57,0 e +71,6, apresentando 64% de eficiência de encapsulamento antigênico, o que demonstrou a elevada plasticidade dos materiais usados na produção das partículas. Desta maneira, foi realizada análise da toxicidade e perfil inflamatório. Nesta etapa, foram analisados três grupos (n=5/tempo) de camundongos BALB/c, que foram acompanhados por até 72 horas após o inóculo intradérmico. Vale destacar que os diferentes inóculos foram realizados na região dorso-lombar, em volume de 100L, sendo avaliados os seguintes grupos experimentais: (i) grupo controle (C) inoculado com de solução salina estéril 0,85%, (ii) grupo partícula branca 1 (PB1) composto pelo inóculo correspondente a solução de SMP capazes de encapsular 60μg de antígeno de L. braziliensis, medindo em torno de 800nm, e, (iii) grupo partícula branca 2 (PB2) composto pelo inóculo correspondente a solução de SMP capazes de encapsular 60μg de antígeno de L. braziliensis, medindo em torno de 400nm. As análises, após os diferentes inóculos, foram realizadas em cinco tempos distintos (1/6/24/48/72 horas). Assim, após cada um dos tempos os animais foram submetidos a eutanásia para coleta de material biológico. Neste sentido, o soro foi coletado antes e após 72 horas dos diferentes inóculos para análise da função hepática (ALT, AST) e renal (ureia e creatinina). Além disto, após os diferentes tempos avaliados, um fragmento de pele da região do inóculo foi destinado a histopatologia, análise de ativação celular por NAG e MPO, e dosagem de citocinas. Não foram observadas alterações locais (nódulo ou ulceração), clínicas e comportamentais, bem como na função hepática e renal. Em relação as análises histopatológicas, a cinética inflamatória revelou infiltrado polimorfonuclear moderado no grupo C, com redução da inflamação local, em 24 horas. Para as PB1 e PB2, após 48 horas do inóculo, foi observado um infiltrado polimorfonuclear variando de moderado a intenso, com hiperemia, macrófagos e linfócitos distribuídos em toda a derme. Após 72 horas do inóculo houve resolução da inflamação no grupo PB1. Por outro lado, o grupo PB2 apresentou manutenção do infiltrado inflamatório, com redução de polimorfonucleares e aumento de células mononucleares, confirmados pela análise dos níveis NAG e MPO (macrófagos e neutrófilos, respectivamente) e presença das citocinas IL-6 e TNF-α. Diante do exposto, neste estudo foi possível concluir que ambas as PSM avaliadas (PB1 e PB2) são potenciais indutoras de inflamação local, sem causar alterações locais e sistêmicas aos animais. Deste modo, estas partículas poderiam ser utilizadas em formulações vacinais anti-Leishmania apresentando a vantagem de desencadear reação inflamatória local (efeito adjuvante), além de serem capazes de encapsular antígenos de L. braziliensis.Item Nanobastões de ouro no desenvolvimento de um método de diagnóstico de paracoccidioidomicose.(2016) Dias, Bruna de Paula; Silva, Breno de Mello; Ferreira, Cyntia Silva; Lana, Gwenaelle Elza Nathalie Pound; Oliveira, Laser Antônio Machado de; Silva, Breno de MelloA paracoccidioidomicose (PCM) é uma micose granulomatosa sistêmica causada por duas espécies de um fungo termodimórfico: Paracoccidioides brasiliensis e Paracoccidioides lutzii. A doença é endêmica na América Latina e apresenta o maior número de casos no Brasil. Embora a maioria das formas clínicas seja assintomática, podem ocorrer infecções severas e progressivas, envolvendo o tecido pulmonar, o sistema nervoso central e pode levar a óbito dependendo da gravidade. Assim, o diagnóstico precoce da doença torna-se essencial para dar início ao tratamento. Apesar disso, ainda não existe um diagnóstico rápido e preciso com custo apropriado para as áreas endêmicas. Nesse sentido, uma alternativa é representada pelo uso de nanobastões de ouro (AuNBs), os quais possuem uma forte absorção característica no espectro visível (ressonância de plasmon) que pode ser monitorada por espectrofotometria. Considerando o uso dos AuNBs como biosensores, os mesmos foram funcionalizados com polietilenoimina e bioconjugados com anticorpos anti-gp43. Tais conjugados foram testados na presença dos alvos purificados e também desafiados com soro de camundongos infectados. A ligação efetiva das biomoléculas em questão foi observada através do deslocamento do pico de absorção plasmônica longitudinal dos AuNBs, sendo satisfatórias quando empregadas as biomoléculas purificadas. Em amostras de soros o sensor não se comportou como esperado. Assim, o deslocamento observado para as biomoléculas purificadas mostram que o sistema deve ser aprimorado para a detecção de antígenos em amostras complexas e pode justificar em parte, o sucesso do sistema de detecção proposto. Além disso, a proposta representa um avanço biotecnológico para o diagnóstico de doenças negligenciadas.Item Ensaio pré-clínico vacinal em hamsters para análise da imunogenicidade de uma nanoformulação contra a leishmaniose visceral.(2016) Cabrera González, Marco Antonio; Giunchetti, Rodolfo Cordeiro; Mosqueira, Vanessa Carla Furtado; Mosqueira, Vanessa Carla Furtado; Rezende, Simone Aparecida; Araújo, Ricardo NascimentoA leishmaniose visceral é causada pelo parasito Leishmania chagasi (sinonímia L. infantum) e tem como medidas de controle preconizada pelo Ministério da Saúde/Brasil a eutanásia do cão doente, principal reservatório do parasito. Diante do impacto social que este procedimento causa perante a sociedade, o desenvolvimento de uma vacina anti-LVC faz-se necessário e torna uma importante medida de controle da transmissão do parasito ao homem. Deste modo, o objetivo deste estudo foi avaliar o potencial de partículas submicrômicas do polímero ácido poli-D,L-láctico (PLA) e quitosana de baixo peso molecular, como carreadoras de antígenos vacinais contra leishmaniose visceral em modelo hamster. Neste contexto, foi realizado um ensaio pré-clínico vacinal com diferentes grupos experimentais, entre os quais: (i) Controle (solução salina estéril a 0,85%); (ii) Saponina (SAP; 100 μg/dose); (iii) Partícula Submicrométrica Pequena vazia (PSmP); (iv) Partícula Submicrométrica Grande vazia (PSmG); (v) Antígeno bruto de Leishmania amazonensis (LA); (v) Antígeno bruto L. amazonensis associado ao adjuvante saponina (LASAP); (vi) Partícula Submicrométrica Pequena contendo antígeno bruto de L. amazonensis (LAPSmP); e (vii) Partícula Submicrométrica Grande contendo antígeno bruto de L. amazonensis (LAPSmG). Dessa maneira, hamsters (Mesocricetus auratus) machos foram inoculados com três doses, por via subcutânea, em intervalo de 21 dias. O desafio experimental foi realizado com 107 promastigotas em fase estacionária de L. chagasi (cepa C46), após 30 dias da última dose. Nos tempos T0 (Antes da 1º dose), T3 (30 dias após o terceiro inóculo) e T180 (180 dias após desafio experimental com L. chagasi, e imediatamente antes da eutanásia), foram feitas coletas de sangue dos animais por punção cardíaca, para realização de teste de função hepática e renal, hemograma e análise dos níveis de IgG anti-Leishmania. Após a eutanásia dos animais, foram coletados baço e fígado para análise da carga parasitária pela técnica de diluição limitante. Os dados obtidos no presente trabalho mostraram que o emprego do polímero poli-D,L-láctico (PLA) de quitosana formulado em partículas submicrométricas associado ao antígeno bruto de L. amazonensis (formulações LAPSmP e LAPSmG) foram inócuos e seguros para administração em hamsters, além de serem imunogênicos e reduzirem drasticamente o parasitismo tecidual. Esta afirmação é baseada nos seguintes achados: (i) alterações locais e clínicas compatíveis com a manutenção dos animais; (ii) testes de função hepática e renal sem alterações; (iii) ausência de anemia e hemólise induzida durante o protocolo vacinal; (iv) indução de linfocitose após o término do protocolo vacinal, particularmente relacionada a formulação LAPSmG; (v) antigenicidade relacionada a produção de IgG total anti-Leishmania após o término do protocolo vacinal; (vi) redução do tamanho do baço, após o desafio experimental por L. chagasi, particularmente relacionada a formulação LAPSmG; (vii) redução da carga parasitária superior a 97% no baço e no fígado. Estes resultados indicam que o encapsulamento de antígeno bruto de Leishmania é uma estratégia que favorece o estabelecimento de imunogenicidade e a obtenção de elevados níveis de proteção contra a LV.