PPBIOTEC - Programa de Pós-graduação em Biotecnologia
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Resultados da Pesquisa
Item Imunogenicidade de três frações antigênicas de Leishmania amazonensis como candidatos vacinais avaliados em hamster contra leishmaniose visceral.(2015) Amorim, Danielle Rodrigues de; Giunchetti, Rodolfo Cordeiro; Giunchetti, Rodolfo Cordeiro; Estanislau, Juliana de Assis Silva Gomes; Mosqueira, Vanessa Carla FurtadoA Leishmaniose é um conjunto de síndromes complexas e multifacetadas causadas por espécies de protozoários do gênero Leishmania, sendo transmitida através da picada de flebotomíneos infectados. Endêmica em 88 países do mundo estima-se que cerca de 350 milhões de pessoas estão em risco de contrair a doença, e aproximadamente 12 a 14 milhões estão infectadas. Cerca de 500 mil pessoas desenvolvem a forma visceral da doença, sendo que 90% dos casos ocorrem na Índia, Bangladesh, Nepal, Sudão, e no Brasil. Diversos pesquisadores no mundo tem buscado respostas para a prevenção da leishmaniose visceral canina (LVC), através da caracterização de antígenos de espécies de Leishmania, já que o cão é considerado o reservatório doméstico do parasito e um importante elo na cadeia epidemiológica de transmissão da doença. Ainda não existe uma vacina que apresente eficácia vacinal compatível para o controle da LVC e que seja recomendada pelo Ministério da Saúde de nosso país como medida profilática da doença. Considerando o hamster amplamente utilizado como modelo experimental em ensaios vacinais com diversos protocolos anti-Leishmania, estabelecemos uma plataforma para testes rápidos in vivo buscando avaliar simultaneamente diferentes candidatos vacinais. Neste sentido, o presente projeto propôs a avaliação de um ensaio pré-clínico vacinal, em hamsters Mesocricetusauratus, considerando aspectos relacionados à inocuidade, toxicidade e imunogenicidade dos candidatos contra leishmaniose visceral, entre os quais: (i) grupo inoculado com salina 0,85% estéril, (ii) grupo inoculado com adjuvante saponina, (iii) grupo inoculado com antígeno bruto de Leishmania amazonensis(LA), (iv)grupo inoculado comantígeno solúvel de L. amazonensis(LASol), (v) grupo inoculado com antígeno particulado de L. amazonensis (LAPart), (vi) grupo inoculado com antígeno bruto de L. amazonensis associado a saponina (LASap), (vii) grupo inoculado com antígeno solúvel de L. amazonensis associado a saponina (LASapSol)e (viii)grupo inoculado comantígeno particulado de L. amazonensis associado a saponina (LASapPart). Os resultados mostraram que nenhuma das formulações vacinais induziu alterações no local do inóculo ou alterações sistêmicas avaliadas pela inspeção clínica e pelo hemograma. Deste modo, ficou constatado que as diferentes formulações vacinais não induziram hemólise ou anemia nos diferentes grupos avaliados. A análise do leucograma revelou linfocitose restrita apenas aos grupos que receberam antígenos vacinais associados ou não ao adjuvante saponina. De forma semelhante, a análise de antigenicidade revelou aumento dos níveis de IgG total anti-Leishmania, acima do cut-off, nos mesmos grupos que apresentaram linfocitose. A análise do immunoblotting, realizada nas formulações em que foi associado antígeno ao adjuvante saponina (LASap, LASapSol, LASapPart), demonstrou a presença de três bandas imunogênicas com peso molecular próximas de 40 kDa, 30 kDa e bandas entre 20 e 30 kDa. As proteínas encontradas nesse trabalho abrem perspectivas para a análise de novas formulações vacinais contra a leishmaniose visceral.Item Peptídeos antigênicos indutores de anticorpos específicos para identificação de alterações de maior prevalência do subtipo 2B da doença de von Willebrand e do fator de von Willebrand normal.(2012) Paro, Marina de Oliveira; Andrade, Milton Hércules Guerra deA doença de Von Willebrand (DVW) é um distúrbio hemorrágico hereditário de caráter autossômico dominante ou recessivo, ocasionado por defeitos quantitativos ou qualitativos do fator de Von Willebrand (FVW). Trata-se da coagulopatia hereditária mais comum na população humana, com prevalência de 1,3% da população. Os defeitos qualitativos são divididos em quatro subtipos (2A, 2B, 2M e 2N) de acordo com a alteração da função do FVW. A classificação dos diversos tipos de DVW se apóia em vários métodos de avaliação da função e da quantidade do FVW, o que dificulta esse diagnóstico tornando-o passível de erros. Diante das dificuldades atuais para o diagnóstico da DVW relacionadas às alterações qualitativas do FVW, esse trabalho apresenta como proposta o emprego de estratégias bioquímicas para a identificação de alterações na estrutura do FVW. Para se desenvolver métodos de isolamento do FvW que utilizem pequenos volumes de amostras de sangue para preparação de amostras para espectrometria de massas, alíquotas de plasma humano passaram por processo de precipitação por etanol e foram tratadas em colunas de gelatina para remover a fibronectina do FVW para isolá-lo como único componente em uma banda de 250 KDa, visando reduzir a possibilidade de supressão provocada por impurezas na espectrometria de massas. Mediante a análise da estrutura cristalográfica, com auxílio de ferramenta computacional, foram definidos 22 peptídeos correspondentes a sequência de aminoácidos encontradas no FVW normal e alterado presentes na DVW tipo 2A, 2B e 2M. Esses peptídeos foram utilizados na obtenção de anticorpos a partir da imunização de camundongos e na purificação dos mesmos em colunas de afinidade. Obtiveram-se quatro preparações anticorpos purificadas para alterações do tipo 2B com prevalência de 90%, além de três preparações de anticorpos purificados para o FVW normal. A obtenção desses anticorpos específicos para o FVW permitirá o uso dos mesmos em análises de multímeros no teste de diagnóstico, atualmente empregado na classificação de DVW, ensaios de capacidade de ligação ao fator VIII e produção de anticorpos monoclonais específicos.