PPBIOTEC - Programa de Pós-graduação em Biotecnologia
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Resultados da Pesquisa
Item Diversidade metagenômica e potencial biotecnológico de cavernas de canga do Quadrilátero Ferrífero.(2018) Lemes, Camila Gracyelle de Carvalho; Moreira, Leandro Marcio; Moreira, Leandro Marcio; Salgado, André Augusto Rodrigues; Silva, Silvana de QueirozO Quadrilátero Ferrífero (QF) possui alta concentração de minérios em seu solo, o que tem propiciado um elevado extrativismo que se contrapõe à sua importância biológica. Nesta área, cavernas de cangas apresentam-se como ambientes com características geomorfológicas únicas. Poucas destas cavernas foram catalogadas e um número ainda mais reduzido foi incorporado em estudos biológicos, o que torna esse geossistema ferruginoso um ambiente altamente propício para novas descobertas de cunho microbiológico e biotecnológico. O objetivo deste trabalho foi investigar a diversidade bacteriana e o potencial biotecnológico em cavernas de canga associadas a aflorame ntos ferruginosos por metagenômica DNAr 16S. Para isso, foram coletadas amostras do piso e do teto de 7 cavernas de canga e 1 caverna de quartzito (controle) na região do QF, em condições estéreis. O DNA total foi extraído e a região V4-V5 da subunidade ribossomal 16S foi sequenciada usando plataforma PGM™. Um total de 6 milhões de leituras foram identificadas. Análise de α-diversidade revelou que as cavernas de canga apresentam maior riqueza em relação à caverna controle. Análise de β-diversidade demonstrou que as cavernas de canga e a de quartzito apresentam classificações filogenéticas distantes, ainda mais quando os estratos piso e teto foram avaliados independentemente. Esta diversidade ficou evidenciada em nível de gênero, muitos dos quais já descritos na literatura como sendo potenciais organismos de interesse biotecnológico, por exemplo Actinoallomurus, Cystobacter e outros. Uma análise mais aprofundada de três das cavernas selecionadas, todas inseridas na região da Chapada de canga no município de Mariana, mostrou que apesar de geograficamente estarem muito próximas, apresenta m riqueza e diversidade significativamente diferentes entre si. Estes resultados colocam em destaque pela primeira vez um patrimônio genético mineiro ainda desconhecido em estudos biológicos e evidenciam a necessidade de incorporação desta área em programa s de conservação, ainda mais por estar sobre iminente pressão pela ação antrópica.Item Caracterização de fungos filamentosos com potencial para biorremediação de águas contaminadas com manganês.(2015) Mota, Ester Alves; Cota, Renata Guerra de Sá; Chinalia, Fábio Alexandre; Rosa, Luiz HenriqueDevido à alta estabilidade do íon manganês (Mn2+) em solução aquosa, existe uma grande dificuldade para removê-lo de águas contaminadas. Uma das formas de remover o Mn2+ é a utilização de microrganismos que podem oxidar o íon Mn2+. Fungos podem remover o Mn2+ por vários mecanismos dentre eles a oxidação mediada por lacase e adsorção. Esse trabalho teve como objetivo isolar fungos a partir de água de drenagem de mineração de Mn e testar a capacidade de biorremoção do íon Mn2+ de cinco isolados (7,18,23,26 e 31). Os fungos foram isolados utilizando Agar batata, mineral e Sabouraud. Os ensaios de biorremoção do Mn2+ pelos isolados foram realizados utilizando-se caldo Sabouraud contendo 140 e 50 mgL-1 do íon Mn2+. O decaimento da concentração de Mn2+ solúvel foi medido por espectrometria de emissão atômica com fonte plasma. Foram realizados ensaios de biorredução usando bióxido de manganês nas mesmas condições. Os fungos foram cultivados em meio suplementado com 2,2'-azino-bis-(3-etilbenzotiazolina-6- ácido sulfônico) para testar a produção de lacases extracelulares. A morfologia foi detectada por microscopia eletrônica de varredura e a composição de metais nas hifas por adsorção, foi caracterizada por EDS. A identificação dos isolados foi realizada utilizando análise filogenética da região do rRNA do 18S e ITS. Foi feito teste com N.N'-Dimetilamino-p,p'- trifenilmetano-o"- ácido sulfônico para detecção de Mn3+ /Mn4+ extracelular. O teste de presença de lacases foi positivo para os isolados 18, 23 e 31. Observou-se uma remoção de Mn2+ de 86,07% e 96% para o isolado 31 em 140 e 50 mgL-1 do íon Mn2+, respectivamente, sem ocorrer redução no ensaio com MnO2. A filogenia sugere que o isolado 7 pertence ao gênero Hypocrea; o isolado 18, Penicillium; o isolado 26, Aspergillus e o isolado 31, Cladosporium. As análises de microscopia eletrônica de varredura corroboram os resultados moleculares. A EDS mostrou que o Mn2+ removido está adsorvido nas hifas apenas de Cladosporium. Hypocrea foi capaz de oxidar Mn2+ a Mn3+ /Mn4+ no meio de cultura. Em conjunto os resultados demonstram que o isolado pertencente ao gênero Cladosporium é o mais eficiente na biorremoção de Mn2+, utilizando o mecanismo de adsorção associado à secreção de lacase extracelular. Novos experimentos serão feitos para verificar se a presença de lacases contribui para a biorremoção ou se a taxa de biorremoção observada é ocasionada somente pela adsorção.Item Desenvolvimento e avaliação de nanoemulsões com extrato etanólico bruto das folhas de Melaleuca leucadendron e cloridrato de pilocarpina para o uso potencial como radioprotetor tópico.(2015) Carvalho, Karen Vitor; Santos, Orlando David Henrique dos; Souza, Gustavo Henrique Bianco deAs radiodermatites são efeitos secundários que podem comprometer a dose e a adesão à radioterapia, em pacientes com câncer. Substâncias radioprotetoras não tóxicas, capazes de prevenir ou minimizar esses danos, são necessárias. A espécie Melaleuca leucadendron e a pilocarpina possivelmente apresentam essa capacidade. O objetivo da pesquisa foi desenvolver e avaliar nanoemulsões com extrato etanólico bruto das folhas de Melaleuca leucadendron e cloridrato de pilocarpina para o uso potencial como radioprotetor tópico. O extrato de M. leucadendron foi obtido e apresentou conteúdo fenólico de 10,23%. O cloridrato de pilocarpina não apresentou capacidade antioxidante. O extrato e o óleo de girassol foram altamente antioxidantes, apresentando CE50 de 17,0 ±0,59 μg/mL e 6,39 ±0,27 mg/mL, respectivamente, pelo método DPPH. Nanoemulsões estáveis foram obtidas combinando óleo de girassol, monoestearato de sorbitano e óleo de rícino hidrogenado e etoxilado, através do método de inversão de fases. Boa incorporação do extrato às nanoemulsões foi obtida ultrassonicando o mesmo com o tensoativo hidrofílico previamente ao aquecimento da fase oleosa. O cloridrato de pilocarpina foi adicionado durante o processo de resfriamento das formulações. A nanoemulsão base e as nanoemulsões com extrato, pilocarpina ou ambos ativos apresentaram tamanho de partícula entre 70 e 80 nm, com baixo índice de polidispersão. Essas quatro emulsões apresentaram pH e temperatura de inversão de fases característicos de sistemas estáveis e condizentes com o método de obtenção utilizado. O potencial zeta dessas nanoemulsões foi superior a 30 mV em módulo, conferindo estabilidade eletrostática às mesmas. As formulações permaneceram inalteradas em até 60 dias de armazenamento, mesmo após os ensaios de estabilidade. Foi observada citotoxicidade dependente das concentrações do extrato e/ou pilocarpina, sendo que nanoemulsões com quantidades totais de ativos inferiores a 500μg/ mL apresentaram viabilidade celular superior a 80%. As nanoemulsões foram capazes de manter, com certa redução, os potenciais antioxidantes do extrato e do óleo de girassol e um possível sinergismo entre os dois foi observado. As formulações com pilocarpina apresentaram atividade antioxidante decorrente do óleo na composição. As concentrações eficazes foram bastante inferiores às com toxicidade acima do aceitável. As nanoemulsões obtidas foram caracterizadas como potenciais radioprotetores para uso tópico, sendo necessário confirmar essa ação em estudos posteriores.Item Envolvimento do íon cálcio na resposta ao estresse ácido em Saccharomyces cerevisiae.(2014) Almeida, Marcos Vinicius Simi; Castro, Ieso de MirandaPara manter sua capacidade produtiva, as células de leveduras precisam adaptar-se às mudanças ambientais que ocorrem durante o processo produtivo. A resposta a baixo pH é de interesse, pois tal exposição ocorre sob condições industriais como no tratamento ácido para redução de contaminação bacteriana antes da reciclagem celular em processos fermentativos. Semelhante à resposta a ácidos orgânicos, a resistência a ácidos inorgânicos envolve mudanças da permeabilidade de membrana, extrusão ativa de H+ e modulação da expressão gênica. O presente trabalho estudou a participação do íon cálcio na resposta ao estresse ácido na levedura Saccharomyces cerevisiae. Os resultados obtidos mostram elevação transitória dos níveis citoplasmáticos de Ca2+ desencadeada por pulso ácido e que esta mudança decorre do influxo de cálcio extracelular e da mobilização vacuolar do íon. Testes de viabilidade celular sugerem que a tolerância da S. cerevisiae a estresse ácido envolve a ativação da via de sinalização da calcineurina dependente de Ca2+/calmodulina e consequente regulação da expressão de alguns genes mediada pelo fator de transcrição Crz1p/Tcn1p. A tolerância dos mutantes nulos da via de sinalização da quinase Snf1p, responsável pela utilização de fontes alternativas de carbono, foi menor em relação à cepa parental BY4741, sugerindo a participação desta via na resposta a baixo pH. Em conjunto, os resultados mostram a importância das vias de sinalização da fosfatase calcineurina e da quinase Snf1p para a resposta da S. cerevisiae a estresse ácido.Item Alterações hepatoesplênicas associadas à infecção por Schistosoma mansoni no modelo murino.(2012) Campos, Jonatan Marques; Borges, William de CastroA Esquistossomose é uma doença endêmica em vários países, afligindo mais de 207 milhões de pessoas no mundo. É considerada a segunda infecção parasitária mais importante em termos de saúde pública devido ao impacto socio-econômico, podendo ocasionar cerca de 200 mil mortes anualmente. A caracterização do genoma e transcriptoma do Schistosoma mansoni propiciou o emprego de técnicas na área da proteômica as quais vem permitindo maior compreensão da biologia deste parasito em todos os estágios de seu ciclo de vida. Entretanto, até o momento, poucos estudos proteômicos abordaram a relação parasito-hospedeiro. O entendimento desta relação é de fundamental importância para a proposição de novos métodos de diagnóstico, avaliação de prognóstico e tratamento da doença. O presente trabalho teve como foco a análise das alterações no proteoma solúvel de fígado e baço, utilizando o modelo murino de infecção por S. mansoni. A primeira abordagem fundamentou-se na discriminação dos estágios de fase aguda e fase crônica nos animais infectados. Após realização do exame parasitológico de fezes, avaliação das alterações hepatoesplênicas através da relação (% órgão/corpo) e histologia de fígado e baço, foi possível estabelecer que o grupo de animais com 5 semanas de infecção desenvolveu a fase aguda da esquistossomose e animais infectados por 7 semanas apresentaram a fase crônica da doença. A técnica de eletroforese bidimensional comparativa, para proteínas solúveis de fígado e baço de animais controles e infectados, demonstrou alterações nos níveis de expressão de proteínas associadas com processos e vias bioquímicas diversas, como resposta ao estresse celular, tradução, ciclo da uréia e via glicolítica. No fígado, a categoria de proteínas chaperoninas apresentou maior número de representantes com alteração de expressão dentre as quais se destacam GRP-78 (proteína reguladora de glicose 78 kDa), HSP-71 (proteína de choque térmico 71 kDa), Erp-60 (calreticulina) e PDI (proteína dissulfeto isomerase). Por outro lado, proteínas como a CPSase I (carbamoil fosfato sintetase I), albumina, indoletilamina N-metiltransferase, peroxirredoxina-6 e anidrase carbônica III apresentaram expressão diminuída no fígado em decorrência da infecção. O perfil proteômico do fígado do animal infectado correlacionou-se com a análise histológica do órgão na qual se observa uma intensa resposta imune celular. No baço, as proteínas identificadas com alteração de expressão foram calreticulina, fosfoglicerato quinase I, frutose-bifosfato aldolase A, gliceraldeído 3 fosfato desidrogenase, EF-Tu, (fator de elongamento) e aspartato aminotransferase. Em geral, as proteínas diferencialmente presentes no baço de animais infectados apresentaram aumento de expressão, sendo o perfil molecular compatível com a demanda de produção de energia e síntese proteica. Estes dois processos são altamente relevantes para o custeio da intensa proliferação celular observada no órgão. Coletivamente, os resultados obtidos demonstraram que a abordagem proteômica empregada permitiu a identificação de marcadores teciduais induzidos pela infecção por S. mansoni. Abordagens futuras permitirão estabelecer se as alterações teciduais decorrentes da infecção pelo parasito alteram significativamente o proteoma plasmático a ponto de indicar novos biomarcadores da esquistossomose.Item Produção, purificação e caracterização de uma lipase de Cylindrocladium pteridis LPF-59.(Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós Graduação, Universidade Federal de Ouro Preto., 2013) Oliveira, Cristina Alves de; Rezende, Sebastião Tavares deEste trabalho teve por objetivo avaliar a produçao de lipase do fungo Cylindrocladium pteridis LPF-59 crescido em diferentes fontes de carbono, puri:ficar, caracterizar e identificar as propriedades bioquimicas da enzima corn potencial para aplicaçao industrial. 0 cultivo do fungo foi realizado em meios de cultura liquida submersa contendo bagaço de cana de açucar, farelo de trigo e resî'duos de viveiro de eucalipto como fonte de carbono. 0 farelo de trigo apresentou maior capacidade de induçao da produçao da lipase. Para produçao da enzima, o microrganismo foi cultivado por 168 boras a 28°C a 180 rpm. 0 sobrenadante da cultura foi fùtrado e submetido às cromatografias de interaçao hidrof6bica e troca iônica para purificaçao da enzima. Ao final do processo, a lipase apresentou um fator de purificaçao de 23,7 vezes e rendimento de 42,7%. A massa molecular da enzima foi estimada em 14,9 kDa por cromatografia de exclusao molecular. Atividades maximas foram detectadas em temperatura de 35°C e pH 9,0, sendo que a enzima manteve 75% de sua atividade inicial quando incubada a 400C por 12 boras e 40% quando incubada a 50 oc por 30 minutos. A atividade enzimatica foi totalmente inibida por HgC}z nas concentraçoes de 1 e 5 mM, e parcialmente inibidas por MnCh, ZnCh, CuSo4, NaCI, MgCh, EDTA e SDS na concentraçao de lmM, mantendo mais de 80% de atividade total. A estabilidade em solventes orgânicos foi estudada por incubaçao da enzima na presença dos solventes isopropanol, acetona, etanol, acetonitrila, hexano e metanol na concentraçao de 25% (v/v) durante12 boras a 25°C. A atividade enzimâtica foi maior na presença de isopropanol, mantendo também mais de 90% de sua atividade na presença de etanol e acetona. A especificidade por substratos sintéticos foi avaliada na presença dos ésteres de p-nitrofenol butirato (C4), Caprilato (C8), Decanoato (CIO), Laurato (Cl2), Miristato (Cl4) e Palmitato (Cl6). A lipase de C. pteridis LPF-59 apresentou maior capacidade de hidr6lise sobre o substrato p-nitrofenol caprilato. A lipase de C. pteridis apresentou capacidade de manter sua atividade enzimatica mesmo ap6s ser submetida a fervura. Diante desses resultados, a lipase de Cylindrocladium pteridis LPF-59 mostrou propriedades relevantes para possfveis aplicaçôes industriais, uma vez que sua atuaçao em baixas temperaturas e pH alcalino siio indicativos de possfveis aplicaçôes na fabricaçiio de detergentes.Item Diversidade e atividade antimicrobiana de fungos endofíticos associados à Araucaria angustifolia (Bertol.) O., Kuntze.(Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós Graduação, Universidade Federal de Ouro Preto., 2013) Moreira, Mirna Giselle; Rosa, Luiz HenriqueFungos endofíticos são caracterizados por habitar, de forma assintomática, tecidos vegetais e estabelecer uma relação considerada mutualística com seus hospedeiros. Este grupo microbiano é reconhecido como uma valiosa fonte de metabólitos secundários com diferentes atividades biológicas. Este trabalho teve como objetivo caracterizar a comunidade de fungos endofiticos associados à Araucaria angustifolia, única gimnosperma endêmica do Brasil, e sua capacidade em produzir metabólitos com atividade antimicrobiana. Para este estudo, 30 espécimes de A. angustifolia foram coletados em Campos de Altitude do estado de Minas Gerais. Folhas e caules de A. angustifolia foram desinfestados superficialmente e inoculados no meio Agar Batata Dextrosado (BDA) para o isolamento de fungos endofíticos. Após o processo de isolamento, 316 isolados fúngicos foram obtidos; destes, 204 das obtidos das folhas e 112 dos caules, os quais foram agrupados em 140 morfotipos distintos pelo perfil eletroforético dos produtos de PCR amplificados com o iniciador (GTG)5. Um isolado de cada morfotipo foi selecionado para sequenciamento da região ITS do gene do rDNA e identificados como espécies pertencentes aos gêneros Aspergillus, Biscogniauxia, Botryosphaeria Cladosporium, Colletotrichum, Diaphorte, Mucor, Muscodor, Neofusicoccum, Neurospora, Penicillium Pezicula, Phomopsis, Pestalotiopsis, Preussia, Trichoderma e Xylaria. Os táxons mais frequentes foram Pestalotiopsis sp. e Xylaria sp. Por outro lado, Mucor circinelloides, Neurospora tetrasperma, Phomopsis chimonanthi, Botryosphaeria sp. e Biscogniauxia sp. foram identificados como táxons minoritários dentro da comunidade. A comunidade de fungos endofíticos de A. angustifolia apresentou elevados valores de diversidade (Fisher-ɑ = 24,01), riqueza (Margalef’s = 8,42) e dominância (Simpson’s = 0,9). Além disso, a curva de rarefação de espécies (Mao Tao), que não atingiu uma assíntota, o que sugere que o número amostral não conseguiu cobrir toda a diversidade da comunidade de fungos endofíticos associados à A. angustifolia. Todos os isolados obtidos foram cultivados e seus respectivos extratos obtidos, os quais foram avaliados contra os micro-organismos alvos Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Candida albicans, C. krusei e Cladosporium sphaerospermum. Vinte e cinco extratos foram ativos contra pelo menos um dos micro-organismos alvos, destes, 21 demonstraram atividade antifúngica seletiva e 4 de amplo espectro. Dentre os extratos vegetais obtidos das folhas e fragmentos de caules, 24 apresentaram atividade antibacteriana contra E. coli e 1 extrato (obtido dos fragmentos de caules) demonstrou atividade antifúngica contra o C. sphaerospermum. O extrato do endófito Pezicula eucrita apresentou concentração inibitória mínima (CIM) de 62,5 μg/ml contra C. albicans. Os resultados obtidos neste estudo demonstram que A. angustifolia, a única gimnosperma endêmica do Brasil, representa uma fonte promissora de diversidade de fungos tropicais. Além disso, algumas espécies endofíticas demonstraram capacidade de produzir metabólitos bioativos e podem ser fontes de moléculas protótipos para fármacos com atividade antimicrobiana.