PPBIOTEC - Programa de Pós-graduação em Biotecnologia
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Resultados da Pesquisa
Item Desenvolvimento de biossensor para detecção direta de Flavivirus utilizando nanobastões de ouro.(2019) Ribeiro, Erica Milena de Castro; Silva, Breno de Mello; Silva, Breno de Mello; Tótola, Antônio Helvécio; Figueiredo, Rute Cunha; Paula, Sérgio Oliveira de; Mosqueira, Vanessa Carla FurtadoA co-circulação de Dengue virus, Zika virus, Yellow fever virus, Chikungunia virus e Mayaro virus tem causado grande impacto na saúde pública brasileira e mundial. Os programas de controle e prevenção de arboviroses e estudos epidemiológicos poderiam ser muito beneficiados e aperfeiçoados com a utilização de metodologias de detecção direta dos vírus em mosquitos, pois possibilitaria uma vigilância mais precisa nas populações de vetores ao longo do tempo. Porém, os métodos de diagnósticos hoje disponíveis, apesar de possuírem alta sensibilidade e especificidade são, em sua maioria, onerosos, demandam treinamento específico para aplicação e interpretação e não provem um diagnóstico rápido. Neste contexto, o desenvolvimento de novas tecnologias de biossensores que apresentem benefícios quanto ao tempo de análise, sensibilidade e simplicidade de manipulação têm sido objeto de pesquisa nas esferas pública e privada. A partir deste fato, este trabalho propõe desenvolver e analisar a eficácia de metodologias de funcionalização de nanobastões de ouro (NBs) com anticorpos específicos anti-DENV2 e anti-flavivirus para testar a capacidade de detecção de ligação anticorpo-partícula viral. A detecção de biomoléculas ligadas às nanopartículas de ouro (AuNPs), tais como proteínas e anticorpos, pode ser feita a partir da análise do seu espectro de absorção. Para isso, nanobastões de ouro foram sintetizados, funcionalizados a 4 mM de polietilenoimina, conjugados a 0,4 μg/mL de anticorpos e incubados com 103 UFP/mL de vírus. Os dados foram obtidos através da leitura da ressonância plasmônica de superfície localizada em espectrômetro de varredura UV-Vis. A síntese dos nanobastões, que utilizou o método de crescimento com sementes com a utilização de diferentes agentes redutores, mostrou-se reprodutível. Além disso, um deslocamento muito expressivo no pico de absorção foi observado quando biossensores contendo anti-flavivirus foram incubados em solução com DENV2 e ZIKV, mas não foi observado após incubação com MAYV, um Alphavirus utilizado como controle negativo. Como esperado, nos biossensores contendo anti-DENV2 o deslocamento foi observado apenas na presença de DENV2, demonstrando a especificidade dos anticorpos utilizados. Na presença de soro humano diluído 1:3200 e macerado de mosquito diluído 8x, contendo DENV2 ou ZIKV, o limite de detecção estimado foi de 100 UFP/mL. Assim, sugere-se que os nanobastões de ouro apresentam potencial para o desenvolvimento de novas metodologias de diagnóstico mais rápidos, precisos e práticos que as técnicas já existentes e viabilizar estudos de vigilância da virologia em mosquitos.Item Desenvolvimento de sistema de diagnóstico de dengue utilizando nanopartículas de ouro.(2015) Ribeiro, Erica Milena de Castro; Silva, Breno de Mello; Santos, Orlando David Henrique dos; Resende, Rodrigo RibeiroA Dengue é transmitida pelo mosquito Aedes Aegypti e é causada pelo Dengue vírus da família Flaviviridae. É conhecida como a arbovirose mais importante da atualidade, colocando aproximadamente metade da população mundial em áreas de risco iminente de transmissão. A ausência de vacinas eficazes e tratamentos específicos pra Dengue tornam necessário um diagnóstico precoce e preciso para esta doença, possibilitando assim, a clínica adequada e oportunas intervenções para prevenir a morbidade grave e a mortalidade. Neste contexto, novos materiais com propriedades químicas e físicas peculiares, tais como nanopartículas de ouro (AuNPs) têm sido utilizadas como biomarcadores. Estas nanopartículas têm propriedades físico-químicas únicas, tal como a oscilação coletiva dos elétrons chamada de ressonância plasmônica, que podem ser facilmente ajustadas. Assim, a detecção de biomoléculas como proteínas e anticorpos ligados às AuNPs pode ser feita a partir do seu espectro de absorção. Dessa forma, o objetivo deste estudo foi desenvolver e analisar a eficácia de metodologias de funcionalização de nanopartículas com anticorpos específicos anti-DENV e anti-flavivirus e a ligação dos mesmos aos antígenos. Para isso, imunoglobulinas foram purificadas por coluna de afinidade e, inicialmente, as nanopartículas de ouro (AuNPs) foram testadas para determinação da melhor concentração de uso dos reagentes: cisteamina (0,5mM) e polietilenoimina (0,3%) e de anticorpos (0,4μg/ml) a serem utilizados. Os resultados foram analisados através da leitura de sua ressonância de plasmon em espectrômetro de varredura UV-Vis e um deslocamento no comprimento de onda foi observado a cada funcionalização, se comparado com AuNPs não funcionalizados e caracterizados anteriormente. Quando as AuNPs foram incubadas em solução com Dengue virus foi possível observar um forte deslocamento nos primeiros minutos de contato. Mas quando incubados com Mayaro virus (Alfavirus) o deslocamento foi observado apenas na presença de alta concentração do vírus, que não é encontrada em amostras naturais, demonstrando a especificidade dos anticorpos utilizados. Assim, sugere-se que as nanopartículas de ouro podem ser utilizadas para um diagnóstico de baixo custo de produção e ser ainda mais rápido, preciso e prático que as técnicas já existentes.