PPBIOTEC - Programa de Pós-graduação em Biotecnologia
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Item Análise de QTL e gênomica comparativa para estudar mecanismos regulatórios da H+ -ATPASE de membrana plasmática de Saccharomyces cerevisiae.(2021) Barbosa, Patrícia Gonçalves Prates; Brandão, Rogélio Lopes; Cunha, Aureliano Claret da; Cruz, Izinara Rosse da; Brandão, Rogélio Lopes; Fietto, Luciano Gomes; Mendes, Tiago Antônio de Oliveira; Andrade, Milton Hércules Guerra de; Silva, Silvana de QueirozA H+ -ATPase é uma proteína presente na membrana citoplasmática de plantas e fungos e desempenha um papel essencial na geração de um gradiente eletroquímico de prótons, importante para a captação de nutrientes e regulação do pH intracelular. A ativação da H + -ATPase da membrana citoplasmática em Saccharomyces cerevisiae induzida por glicose é supostamente atribuída a um sinal de cálcio intracelular correlacionado ao metabolismo do fosfatidilinositol. Em estudos anteriores do nosso grupo de pesquisa, foi observada diferença de fenótipo entre as cepas S. cerevisiae BY4742 arg82Δ e PJ69 arg82Δ através do teste de atividade da H + -ATPase, indicando que o fenótipo de maior ativação da H + -ATPase está relacionado a vários genes. Diante do exposto, o objetivo deste trabalho foi utilizar diferentes abordagens genômicas para identificar novos componentes da regulação induzida por glicose da H + -ATPase. Para isso, foram realizados o sequenciamento do genoma segregante agrupado, mapeamento de QTLs e análises de Bioinformática para identificar o possível motivo da diferença de fenótipo e, ou, novos componentes desta via de transdução de sinal. Uma vez identificadas as variantes na análise de mapeamento de QTL foi desenvolvido o script SNPsInQTLselection.py para identificar as bases genéticas que podem estar envolvidas com o fenótipo de maior atividade da H+ -ATPase. Após a utilização desse script foram identificadas 42 variantes em 33 genes potencialmente envolvidos com o fenótipo de interesse. Para priorização desses genes candidatos foi realizado análise de enriquecimento e interatoma que permitiram identificar 10 genes enriquecidos e envolvidos na via da telomerase e do fosfatidilinositol (STT4, PIK2, UGA2, EST1, MEC3, HEK2, TOP3, PSO2, STO1, FUR4). Cepas do background BY contendo essesrespectivos genes deletados (coleção EUROSCARF) foram utilizadas para teste de fenótipo de acidificação extracelular e sinalização de cálcio induzida por glicose. Por meio desses testes, 4 (UGA2, FUR4, EST1 e STT4) dos 10 genes enriquecidos, apresentaram o fenótipo de maior ativação da H+ -ATPase, fenótipo esse evidenciado nos testes de acidificação extracelular e sinal de cálcio. Destes 4 genes, vale destacar o STT4 visto que, de acordo com a função descrita para esse gene na literatura o fosfatidilinositol-4-fosfato pode exercer um papel na regulação da via de ativação de H + -ATPase, controlando a atividade da fosfolipase C. Tendo em vista uma relação positiva entre atividade da H + - ATPase e desempenho fermentativo, estudos futuros podem ser feitos com os genes/alelos identificados neste trabalho, com aplicação em cepas de leveduras industriais visando a melhoria na eficiência de processos fermentativos. Os genes (UGA2, FUR4, EST1 e STT4) merecem investigação detalhada para verificação do possível envolvimento na via de sinalização da H+ -ATPase. Esse trabalho apresenta pela primeira vez uma estratégia de Bioinformática para identificar genes candidatos quando o resultado do mapeamento de QTL não for significativo.Item Análise proteômica dos alvos ligantes de niclosamida em extrato solúvel de Limnoperna fortunei Dunker, 1857.(2023) Nilsen, Luis Henrique Flores; Borges, William de Castro; Andrade, Milton Hércules Guerra de; Borges, William de Castro; Sanson, Ananda Lima; Cabral, Fernanda JankuA espécie Limnoperna fortunei (Dunker, 1857), é um molusco bivalve, conhecido popularmente como mexilhão dourado o qual representa atualmente um sério problema ambiental e econômico. Este trabalho teve como objetivo a caracterização do proteoma solúvel de L. fortunei por meio de cromatografia de afinidade com imobilizante niclosamida para a prospecção de possíveis alvos ligantes desse moluscicida. Para este fim, a niclosamida foi reconstruída no adsorvente em resina de Sepharose 4B. O extrato total do mexilhão dourado, L. fortunei, foi aplicado à coluna de afinidade e após lavagens sucessivas da coluna, as proteínas ligantes foram eluídas com niclosamida/DMSO. Em seguida, procedeu-se com a identificação em larga escala das proteínas eluídas por meio de cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas (LC-MS/MS). A interrogação dos dados espectrais, contra o proteoma predito de L. fortunei, permitiu a identificação de 221 grupos de proteínas. A anotação das proteínas identificadas foi realizada por meio de busca de similaridade, utilizando o algoritmo BLASTp. Dentre as proteínas identificadas destacam-se aquelas pertencentes ao citoesqueleto, como actina beta 1, tubulinas (isoformas alfa e beta), além de proteínas relacionadas ao estresse e imunidade tais como proteínas de choque térmico, sendo elas: HSP90, HSP70 e HSP20 e calreticulin. Os resultados obtidos permitiram agregar conhecimento molecular ao mecanismo de ação da niclosamida bem como apontar novas possibilidades para intervenção no controle da proliferação deste molusco invasor.Item Análises de QTL e genômica comparativa para estudar mecanismos regulatórios da H+-ATPase de membrana.(2021) Barbosa, Patrícia Gonçalves Prates; Brandão, Rogélio Lopes; Cunha, Aureliano Claret da; Cruz, Izinara Rosse da; Brandão, Rogélio Lopes; Fietto, Luciano Gomes; Mendes, Tiago Antônio de Oliveira; Andrade, Milton Hércules Guerra de; Silva, Silvana de QueirozA H+ -ATPase é uma proteína presente na membrana citoplasmática de plantas e fungos e desempenha um papel essencial na geração de um gradiente eletroquímico de prótons, importante para a captação de nutrientes e regulação do pH intracelular. A ativação da H + -ATPase da membrana citoplasmática em Saccharomyces cerevisiae induzida por glicose é supostamente atribuída a um sinal de cálcio intracelular correlacionado ao metabolismo do fosfatidilinositol. Em estudos anteriores do nosso grupo de pesquisa, foi observada diferença de fenótipo entre as cepas S. cerevisiae BY4742 arg82Δ e PJ69 arg82Δ através do teste de atividade da H + -ATPase, indicando que o fenótipo de maior ativação da H + -ATPase está relacionado a vários genes. Diante do exposto, o objetivo deste trabalho foi utilizar diferentes abordagens genômicas para identificar novos componentes da regulação induzida por glicose da H + -ATPase. Para isso, foram realizados o sequenciamento do genoma segregante agrupado, mapeamento de QTLs e análises de Bioinformática para identificar o possível motivo da diferença de fenótipo e, ou, novos componentes desta via de transdução de sinal. Uma vez identificadas as variantes na análise de mapeamento de QTL foi desenvolvido o script SNPsInQTLselection.py para identificar as bases genéticas que podem estar envolvidas com o fenótipo de maior atividade da H+ -ATPase. Após a utilização desse script foram identificadas 42 variantes em 33 genes potencialmente envolvidos com o fenótipo de interesse. Para priorização desses genes candidatos foi realizado análise de enriquecimento e interatoma que permitiram identificar 10 genes enriquecidos e envolvidos na via da telomerase e do fosfatidilinositol (STT4, PIK2, UGA2, EST1, MEC3, HEK2, TOP3, PSO2, STO1, FUR4). Cepas do background BY contendo essesrespectivos genes deletados (coleção EUROSCARF) foram utilizadas para teste de fenótipo de acidificação extracelular e sinalização de cálcio induzida por glicose. Por meio desses testes, 4 (UGA2, FUR4, EST1 e STT4) dos 10 genes enriquecidos, apresentaram o fenótipo de maior ativação da H+ -ATPase, fenótipo esse evidenciado nos testes de acidificação extracelular e sinal de cálcio. Destes 4 genes, vale destacar o STT4 visto que, de acordo com a função descrita para esse gene na literatura o fosfatidilinositol-4-fosfato pode exercer um papel na regulação da via de ativação de H + -ATPase, controlando a atividade da fosfolipase C. Tendo em vista uma relação positiva entre atividade da H + - ATPase e desempenho fermentativo, estudos futuros podem ser feitos com os genes/alelos identificados neste trabalho, com aplicação em cepas de leveduras industriais 8 visando a melhoria na eficiência de processos fermentativos. Os genes (UGA2, FUR4, EST1 e STT4) merecem investigação detalhada para verificação do possível envolvimento na via de sinalização da H+ -ATPase. Esse trabalho apresenta pela primeira vez uma estratégia de Bioinformática para identificar genes candidatos quando o resultado do mapeamento de QTL não for significativo.Item Análises genômicas para otimização da produção de compostos aromatizantes por estirpe de Saccharomyces cerevisiae isolada de produção de cachaça.(2018) Araújo, Thalita Macedo; Brandão, Rogélio Lopes; Diniz, Raphael Hermano Santos; Mendes, Tiago Antônio de Oliveira; Borges, William de Castro; Fietto, Luciano Gomes; Brandão, Rogélio Lopes; Andrade, Milton Hércules Guerra deA qualidade das bebidas alcoólicas está intimamente relacionada à presença de concentrações equilibradas de compostos voláteis, subprodutos do processo de fermentação alcoólica e altamente influenciados pela linhagem da levedura utilizada de tal modo que a compreensão das bases moleculares da produção de compostos desejáveis represente a possibilidade do incremento da qualidade de bebidas fermentadas visando a agregação de valor ao produto final. O presente trabalho tem como objetivo realizar uma análise de características genéticas e fisiológicas das leveduras isoladas da produção de cachaça com potencial para aplicação na produção de outras bebidas alcoólicas. Desse modo, 118 linhagens da coleção LBCM foram avaliadas quanto a capacidade de metabolização de maltose, produção de baixas concentrações de sulfeto de hidrogênio, capacidade de transporte de maltotriose e capacidade de produção de compostos voláteis. A despeito de sua origem comum, as leveduras avaliadas apresentaram diferenças significativas em sua fisiologia. Algumas dessas leveduras apresentam potencial biológico para aplicação na produção de outras bebidas, como, por exemplo, cerveja. A linhagem LBCM1073 foi selecionada dentre as demais por ser heterotálica e pela sua capacidade de produção de acetato de isoamila, um éster altamente desejável em diversas bebidas alcoólicas. Após sequenciamento genômico dessa levedura, com cobertura de 263 vezes e a predição de 5686 genes, análises de genômica comparativa revelaram que a linhagem LBCM1073 apresenta um conjunto de 24 genes ausentes na linhagem laboratorial S. cerevisiae S288c. Alguns desses genes apresentam similaridade com S. bayanus e Lachancea sp. Um total de 64,15% dos genes da linhagem LBCM1073 apresenta ortólogos com genes de 40 ascomicetos avaliados. Dentre as vias já mencionadas na literatura como relacionadas à produção de compostos voláteis, a via de sinalização mTOR e a glicólise, são as que apresentaram maior percentual de genes ortólogos, justificado pela ampla distribuição dessas duas vias dentre os organismos utilizados para análise. Ao serem comparadas as sequências de aminoácidos de 34 enzimas,relacionadas à produção de compostos responsáveis por aromas, 13 foram idênticas entre LBCM1073 e S. cerevisiae S288c. Para as demais, as proteínas codificadas por LEU4, PMA1, RSP5, TOR1 e FAS2 não apresentaram as substituições descritas na literatura como relacionadas à maior produção de compostos on flavour. Em conjunto, esses dados mostram que LBCM1073 e S. cerevisiae S288c apresentam diversas distinções a nível genômico. Uma metodologia capaz de contribuir para melhor elucidar essas diferenças em relação à produção de compostos secundários à fermentação é a técnica de BSA (Bulked Segregants Analisys) ou análise de agrupamentos de segregantes. As análises fenotípicas de segregantes obtidos do cruzamento entre LBCM1073 e S. cerevisiae S288c revelou uma discreta relação direta entre a capacidade de conversão de álcool isoamílico em acetato de isoamila e o crescimento na presença de TFL 0,5 mM. Além disso, os segregantes já obtidos e avaliados poderão ser empregados na análise de QTLs envolvidos na produção de acetato de isoamila.Item Atividade anti-angiogênica de inibidores de tripsina em membrana corioalantóica de Gallus domesticus.(Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós Graduação, Universidade Federal de Ouro Preto., 2013) Ferreira, Cyntia Silva; Andrade, Milton Hércules Guerra deOs inibidores do tipo Bowman-Birk (BBI) são proteínas contendo dois domínios inibitórios distintos para enzimas tripsina- e quimotripsina-símile. Muitos trabalhos mostram o uso desses inibidores como agentes anti-cancerígenos, no entanto, estudos prévios do nosso laboratório revelaram uma biodistribuição limitada do BBI. Peptídeos sintéticos análogos aos domínios inibitórios do BBI também apresentaram baixa biodisponibilidade, possivelmente devido à degradação. Com o objetivo de construir inibidores mais estáveis foram adicionados motivos do tipo dedo de zinco – sequências de aminoácidos com reconhecida função estabilizadora. Esses inibidores (CPI- e HPI-trip, para tripsina e CPI- e HPI-quimo, para quimotripsina) foram comparados ao inibidor nativo e às suas respectivas alças de inibição YCT-trip e YCA-quimo. A estabilidade dessas espécies químicas foi testada do ponto de vista térmico, redutor e de resistência à hidrólise. Os peptídeos sintéticos contendo dedo de zinco mostraram comportamento similar aos inibidores convencionais. A atividade biológica dos inibidores foi avaliada no complexo proteolítico proteassoma 20S de Ratos Wistar e em membrana corioalantóica de Gallus gallus domesticus. Os inibidores de quimotripsina apresentaram atividade inibitória sobre o proteassoma 20S, mas não geraram alterações na membrana corioalantóica. Da mesma forma, os análogos contendo o motivo dedo de zinco apresentaram baixa atividade tanto no proteassoma quanto na membrana. Por outro lado, os inibidores de tripsina apresentaram atividade inibitória sobre o proteassoma e produziram respostas anti-angiogênicas na concentração de 100 nM, de maneira relacionada à atividade da pentamidina, – uma droga com elevada atividade anti-tripsina. Ao contrário da pentamidina, o inibidor Bowman-Birk é considerado isento de toxicidade em humanos, colocando essa classe de inibidores como potenciais drogas anti-angiogênicas.Item Atividade antiangiogênica de inibidores de tripsina.(2015) Vieira, André Francisco de Castro; Andrade, Milton Hércules Guerra de; Andrade, Milton Hércules Guerra de; Castro, Ieso de Miranda; Cardoso, Leonardo MáximoOs inibidores Bowman-Birk, comumente chamados de BBI, são moléculas proteicas caracterizadas pela presença de dois domínios independentes, capazes de inibir serino-proteases. Embora os mecanismos de atividade biológica dessas moléculas não estejam totalmente elucidados, o interesse por essa classe de inibidores está relacionado com a descoberta de que o BBI pode atuar como agente preventivo do câncer. A capacidade do BBI de prevenir a carcinogênese tem sido estudada extensivamente, tanto em sua forma purificada quanto na forma de extrato proteico de soja enriquecido de BBI, chamado de BBI concentrado (BBIC). Parte do efeito antitumoral pode estar relacionada a uma possível atividade anti-angiogênica, uma vez que proteases que degradam a matriz extracelular podem ter atividade reduzida na presença de inibidores de tripsina. Esse trabalho teve como proposta a avaliação da atividade anti-angiogênica de inibidores de tripsina e domínios sintéticos relacionados ao BBI. Nesse sentido foram avaliados os peptídeos inibidores de tripsina e quimotripsina, sintetizados pelo nosso grupo de pesquisa utilizando-se o protocolo de síntese em fase sólida estabelecido por Merrifield (1963), o BBI purificado através de cromatografia de troca iônica, o inibidor de semente de abóbora CMTI purificado pelo método de cromatografia de afinidade e pentamidina. O inibidor BBI quando purificado em cromatografia de troca iônica demonstrou alta capacidade anti-angiogênica nas doses de 7000 até 70 pmols, enquanto quando purificado em cromatografia de afinidade ocorre à perda de praticamente toda sua atividade antitripsina e antiangiogênica, demonstrando a importância da integridade desse domínio na atividade. Os peptídeos sintéticos também foram ativos entre as doses de 7000 a 700 pmols, sendo a maior atividade observada para o peptídeo inibidor de tripsina. O inibidor de abórora purificado em cromatografia de afinidade também apresentou resposta anti-angiogênica nas concentrações de 7000 a 700 pmols em intensidade semelhante ao inibidor de tripsina sintético. A atividade ani-angiogênica associada à inibição de tripsina promovida pelos inibidores naturais e análogos gerou uma resposta máxima de 40% de redução da angiogênese. Entretanto, a pentamidina apresentou-se ativa entre doses de 7000 a 7 pmols com uma redução de até 80% na angiogênese, possivelmente, pelo fato de apresentar uma atividade antiproliferativa além da inibição de proteases. Esses resultados reforçam as evidências que inibidores de tripsina são dotados de atividade anti-angiogênica e que inibidores proteicos com propriedades antitumorais, como o BBI, podem exercer em parte, sua ação mediante a inibição da angiogênese.Item Atividade cicatrizante de peptídeos sintéticos ricos em prolina e argina em modelo de escisão cutânea do dorso de Mus musculus swiss.(2018) Fernandes, Arádia Gonzales de Oliveira; Andrade, Milton Hércules Guerra de; Babá, Élio Hideo; Cardoso, Leonardo Máximo; Andrade, Milton Hércules Guerra deA pele é o maior órgão do corpo humano e possui funções cruciais na manutenção da homeostase assim como na saúde geral. As feridas são o resultado de lesões na pele e podem ser causadas por queimaduras, insetos, agentes microbianos, diabetes, isquemia e trauma. A cura de feridas é um processo essencial para reestabelecer a barreira protetora que defende o corpo do ambiente. Tipicamente, a cicatrização aguda de feridas é um processo bem organizado que leva a um reparo tecidual previsível, com plaquetas, queratinócitos, células imunológicas, células microvasculares e fibroblastos desempenhando papéis importantes na restauração da integridade tecidual. A cicatrização é um processo evolutivo conservado entre as espécies e abrange processos distintos, entretanto sobrepostos espacialmente e temporalmente que incluem a hemostasia/coagulação, inflamação, proliferação celular/reepitelização e a remodelação da matriz extracelular. Proteínas possuem um papel fundamental em todos os processos biológicos, sendo o equilíbrio finamente regulado entre a síntese e degradação fator decisivo na homeostase celular. O peptídeo natural da família das cateciclinas PR-39 (RRRPRPPYLPRPRPPPFFPPRLPPRIPPGFPPRFPPRFP) é um peptídeo natural rico em prolina e arginina secretado por macrófagos que teve sua capacidade de inibir a atividade catalítica do proteassoma 20S demonstrada assim como capacidade anti-inflamatória, através da inibição da degradação de fatores IκB, e angiogênica pela inibição da degradação de HIF-1α. Em estudos anteriores, foi demonstrado uma atividade inibitória sobre o proteassoma assim como uma atividade angiogênica de análogos ao PR-39. A análise do resultados da área da ferida, demonstra aumento da velocidade cicatrizante para o PR-11 e F-12 no décimo dia na concentração de 10-5 M, e no sétimo e décimo dia nas concentrações de 10-4 M e 10-3 M. O Bephantol® a 10-4 M, um cicatrizante clássico com dexpantenol (pré-vitamina B5), foi utilizado como controle positivo. Este apresenta aumento da velocidade de fechamento da ferida apenas no décimo dia de tratamento. Os análogos PR-11 e F12 apresentaram uma presença inferior de exudado indicativo de infecção na concentração avaliada de 10-4 M a partir do sétimo dia e o controle positivo com Bephantol® 10-4 M apresentou essa atividade apenas no décimo dia de tratamento. Esses resultados indicam a atividade antimicrobiana apresentada pelos análogos. Assim, a capacidade de aumento na velocidade de cicatrização da ferida assim como a diminuição da infecção das mesmas, torna os análogos PR-11 e F-12 ótimos candidatos a criação de formulação para utilização como cicatrizante.Item Avaliação da atividade antiangiogênica do peptídeo sintético análogo a lunasina e do inibidor bowman-birk em membrana coriolantóica de gallus domesticus.(2014) Vieira, Fernanda Silva; Andrade, Milton Hércules Guerra deA angiogênese ou neovascularização é um processo que inclui a ativação, adesão, proliferação e transmigração de células a partir de vasos sanguíneos pré-existentes, formando novos vasos. Para que isso ocorra, as células endoteliais devem primeiramente escapar da sua localização estável, através da ruptura da membrana basal, mediada por serino proteases (SPs) e metaloproteases (MPs) e migrar em direção ao estímulo angiogênico. Neste sentido, o equilíbrio entre as proteases e seus inibidores endógenos é necessário para manter a homeostase celular e a angiogênese fisiológica. Os inibidores de proteases do tipo Bowman-Birk (BBI) são proteínas caracterizadas pela presença de dois domínios independentes, capazes de inibir proteases tripsina-símile e quimotripsina-símile. Dotado de capacidade antitumoral essa molécula pode atuar inibindo proteases envolvidas na angiogênese. A capacidade do BBI de prevenir a carcinogênese tem sido comprovada, tanto em preparações enriquecidas, o BBI concentrado (BBIC) quanto em preparações purificadas. Entretanto, essa atividade antitumoral pode estar relacionada à presença de outras substâncias em sua preparação. Mais recentemente a Lunasina tem sido apontada como o principal componente responsável por tal atividade. O mecanismo de ação proposto para a Lunasina está relacionado à capacidade de inibição da acetilação de histonas, regulando a desespiralização da cromatina e assim, inibindo a proliferação celular. O presente trabalho teve como objetivo avaliar o potencial antiangiogênico de ambas as substâncias tendo em vista a possibilidade de inibição de enzimas proteolíticas pelo BBI e a atividade antiproliferativa da Lunasina. A avaliação do potencial antiangiogênico foi realizada através do Ensaio em Membrana Corioalantóica (CAM) de Gallus domesticus. Para identificar as atividades biológicas dessas proteínas da soja e explorar os possíveis mecanismos relacionados à atividade antiangiogenica, o domínio ativo da Lunasina (PL22) foi sintetizado e testado no ensaio de CAM in vivo. Testamos ainda o BBI purificado a partir de sementes de soja e a associação de PL22 e BBI. O peptídeo PL22 e o BBI apresentaram atividade na redução de vasos sanguíneos, a partir da dose de 7000 pmol. A porcentagem de redução do número de bifurcações em relação ao controle foi de 18% para o BBI na dose de 70 pmol e de 31% para o peptídeo PL22 na mesma dose. Entretanto não foi verificado efeito cooperativo ou sinérgico na associação do peptídeo PL22 com o BBI. Não foram observadas variações na expressão dos marcadores conexina-43 e VEGF pela técnica de Western blotting, sugerindo esses marcadores não estão relacionados ao mecanismo de ação do BBI e PL22. Os resultados da análise corroboram as avaliações feitas pela contagem direta dos vasos em microscópio digital do ponto de vista do efeito antiangiogênico. Além disso, foi observada uma atividade antinflamatória pra ambas as subtâncias. A apreciação dos perfis eletroforéticos bidimensionais de extratos das membranas corioalantóicas tratadas com BBI e PL22 demonstram uma expressão de proteínas diferencial em relação ao controle que permitirá a identificação de possíveis marcadores visando esclarecer o mecanismo e confirmar molecularmente os efeitos constatados.Item Avaliação da expressão gênica de tecidos intestinais neoplásicos de ratos tratados com dibenzotiofeno e naftaleno.(2016) Miranda, Denise Coutinho de; Andrade, Milton Hércules Guerra de; Rodrigues, Cibele Velloso; Andrade, Milton Hércules Guerra de; Isoldi, Mauro César; Oliveira, Laser Antônio Machado deO objetivo do presente estudo foi investigar a expressão gênica em intestino delgado de ratos Wistar submetidos aos regimes crônicos de administração de dibenzotiofeno e compará-los ao naftaleno. Ratos Wistar foram divididos em seis grupos experimentais: CON-12 – Controle, 12 semanas; CON-18 – Controle, 18 semanas; DBT-12 – Dibenzotiofeno, 12 semanas; DBT-18 – Dibenzotiofeno, 18 semanas; NAF-12 – Naftaleno, 12 semanas; NAF-18 – Naftaleno, 18 semanas. Os animais dos grupos NAF-12 e DBT-12 foram tratados durante 12 semanas com 0,7 mmols/Kg, dos respectivos compostos carcinógenos. Os grupos NAF-18 e DBT-18 foram tratados durante 18 semanas e submetidos a 8 semanas de latência, com 0,7 mmols/Kg, dos respectivos compostos. Os ratos do grupo controle foram submetidos aos mesmos procedimentos, porém sem a aplicação dos carcinógenos. Foram avaliadas a expressão gênica de 87 genes envolvidos com o processo da carcinogênese. Com o objetivo de quantificar os níveis de mRNA dos genes selecionados, foi realizada técnica de qPCR, seguido da análise pelo método de quantificação relativa da expressão gênica (ΔCq). Os genes alvos foram normalizados pelo gene 18S, 2-ΔCq e escore Z. Para a análise de enriquecimento dos genes foi utilizada ferramenta de bioinformática “The Rat Genome Database 2015”. Os resultados obtidos demonstram 81 regulações positivas e 4 negativas para o NAF-12; 83 regulações positivas e 4 negativas para o DBT-12; 69 regulações positivas e 6 negativas para NAF-18; 36 regulações positivas e 43 negativas para DBT-18. Identificou-se um perfil de expressão gênica que é característico para o DBT e naftaleno consistentes com a indução de neoplasia e câncer. O perfil da regulação dos genes envolvidos na progressão tumoral após a interrupção do estímulo permite concluir, que em ratos, as exposições ao naftaleno mantem por mais tempo, em maior parte dos marcadores, uma resposta mais intensa no sentido da evolução do câncer quando comparado ao DBT. Por outro lado, alguns genes muito importantes na avaliação do câncer apresentaram uma regulação exclusiva para o tratamento com DBT em relação ao naftaleno e consistente com a manutenção dessa patologia após a latência.Item Cromatografia de afinidade pelo ácido ε-aminocapróico para purificação e depleção de anticorpos em condições otimizadas para preservação estrutural e funcional.(2014) Neves, Leandro Xavier; Borges, William de Castro; Andrade, Milton Hércules Guerra de; Borges, William de Castro; Fonseca, Cristina Toscano; Castro, Ieso de MirandaImunoglobulinas ou anticorpos são glicoproteínas produzidas pelas células B. Estas moléculas podem ser encontradas ancoradas na membrana plasmática da célula produtora ou em fluidos corporais, como sangue e líquido ascítico, na sua forma secretada. Sua estrutura tridimensional revela uma organização básica correspondente à associação das cadeias polipeptídicas leve e pesada. A capacidade de reconhecimento molecular altamente específico faz dessas moléculas poderosas ferramentas nas ciências biomédicas, sendo úteis nas pesquisas científicas, métodos de diagnóstico e imunoterapias. Anticorpos são obtidos a partir de soro de animais ou culturas celulares após rigorosas etapas de purificação, que se destinam à remoção de contaminantes comuns como vírus, pirogênios e proteínas abundantes. Particularmente, o isolamento de anticorpos utilizando cromatografia de afinidade permite sua purificação e depleção em amostras de plasma, precedendo as análises proteômicas. Embora vários procedimentos para purificação/depleção de anticorpos estejam atualmente disponíveis, algumas limitações como especificidade restrita à determinadas classes e espécies e alto custo, justificam o desenvolvimento de métodos alternativos. O objetivo deste trabalho foi a síntese de matrizes cromatográficas, utilizando ácido ε-aminocapróico (AEAC), para purificação e depleção de anticorpos. Quatro, das cinco, matrizes obtidas exibiram especificidade por anticorpos plasmáticos humanos e IgY da gema do ovo de Gallus gallus. O emprego de condições cromatográficas brandas, especialmente eluição em pH fisiológico e baixa força iônica, permitiu a recuperação de anticorpos funcionais, como revelado por Western blotting. O perfil eletroforético bidimensional, seguido da análise por espectrometria de massas, revelou uma heterogeneidade de isoformas e a purificação dos isotipos humanos IgG1,2,3,4, IgA1, IgD, IgM e IgY de Gallus gallus, com alto grau de pureza. Além disso, a imobilização do ácido ε-aminocapróico em micropartículas magnéticas constitui uma estratégia bem sucedida de depleção plasmática de anticorpos, a partir de pequenos volumes. Por último, a avaliação do desempenho das matrizes sintetizadas revelou a melhor capacidade de retenção da matriz pré-ativada NHS-AEAC (30 mg de anticorpo/g). Concluímos que o acoplamento do ácido ε-aminocapróico em suportes cromatográficos constitui uma alternativa para a purificação e depleção de anticorpos plasmáticos e IgY, revelando-se como uma nova ferramenta de interesse biotecnológico.Item Desenvolvimento de nanoemulsão a partir do óleo essencial de folhas de Cymbopogon densiflorus (Steud.) Stapf. : avaliação da sazonalidade e atividades biológicas.(2015) Seibert, Janaína Brandão; Santos, Orlando David Henrique dos; Souza, Gustavo Henrique Bianco de; Conceição, Edemilson Cardoso da; Andrade, Milton Hércules Guerra deSubstâncias químicas presentes especificamente em plantas podem apresentar diferentes propriedades biológicas e serem utilizadas como princípios ativos no desenvolvimento de novos produtos. Cymbopogon densiflorus é utilizada popularmente no tratamento de várias enfermidades e estudos sobre o óleo essencial desta espécie revelaram os monoterpenos como sendo seus principais constituintes. Este trabalho teve o propósito de desenvolver nanoemulsões contendo o óleo essencial de folhas de C. densiflorus, seguido do estudo da sazonalidade e avaliação de atividades biológicas. O óleo essencial foi obtido pela hidrodestilação das partes aéreas desta espécie e a sazonalidade foi analisada a cada dois meses por CG/EM. Os maiores rendimentos do óleo foram obtidos entre o período de novembro a março, havendo manutenção de mais de 90% da sua composição para todo o período analisado. As nanoemulsões foram preparadas através do método de inversão de fases, apresentando um aspecto branco leitoso e homogêneo. Amostras da formulação foram avaliadas quanto ao tamanho médio das partículas, obtendo valores em torno de 76 nm e índice de polidispersão inferior a 0,1. O valor médio do pH foi de 3,277 e um perfil de condutividade elétrica característico da inversão de fases foi observado. O potencial zeta foi próximo de -9 mV e o comportamento reológico evidenciou-se do tipo newtoniano. Além disso, a nanoemulsão demonstrou ser estável após submissão ao estresse térmico e centrifugação. A avaliação qualitativa da atividade antimicrobiana foi realizada a partir do ensaio de difusão em disco, utilizando-se cepas das bactérias Escherichia coli ATCC25922, Staphylococcus aureus ATCC25923, Pseudomonas aeruginosa ATCC27853, além da levedura Candida albicans ATCC14408. Todos os microrganismos foram sensíveis ao óleo essencial e, posteriormente, essa propriedade foi quantificada pela técnica da microdiluição seriada. A atividade antioxidante foi avaliada por meio do método de sequestro de radicais livres e os valores da CI50% da quantidade inicial de DPPH para o ácido gálico, óleo essencial e nanoemulsão foram equivalentes a 1,09x10-3; 14,689 e 73,840 mg/mL, respectivamente. E, por fim, o potencial alelopático foi determinado através de bioensaios de germinação sobre sementes de alface (Lactuca sativa), pepino (Cucumis sativus) e tomate (Lycopersicum esculentum). O óleo puro e sua forma nanoemulsionada apresentaram valores efetivos da CI50% da germinação e do crescimento da raiz para todas as sementes. Desta forma, foi possível demonstrar a viabilidade de preparar nanoemulsões contendo o óleo essencial de folhas de C. densiflorus e a capacidade destas em manter ou até mesmo aumentar o efetivo desempenho do óleo diante das propriedades antimicrobiana, antioxidante e alelopática.Item Estudo da interação molecular da Nitazoxanida por meio de uma abordagem proteômica e efeitos sobre danos teciduais.(2019) Barroso, Nauhara Vieira de Castro; Andrade, Milton Hércules Guerra de; Andrade, Milton Hércules Guerra de; Isoldi, Mauro César; Giunchetti, Rodolfo CordeiroA Nitazoxanida (NTZ) é um antiparasitário de amplo espectro de ação utilizado no tratamento de infecções intestinais ocasionados por helmintos, protozoários e gastroenterites virais causadas por Rotavírus e Norovírus. Além disso, estudos demonstraram que a NTZ apresenta atividades antibacterianas, anti-inflamatórias, antivirais e antitumorais. O amplo espectro de atividade está relacionado tanto a NTZ, quanto ao seu metabólito ativo Tizoxanida (TIZ). No entanto, alguns efeitos colaterais podem ser observados após ingestão desse fármaco. Poucos estudos foram realizados com o objetivo de investigar as interações da NTZ com proteínas de mamíferos e o seu efeito em células normais, tendo em vista seu efeito antiproliferativo em células tumorais. Diante disso, no presente trabalho, a TIZ foi imobilizada em Sepharose 4B e submetida a ligação com homogenatos de encéfalo, rim, fígado e intestino de ratos Wistar, com o objetivo de isolar e identificar proteínas que interagem de forma específica com a TIZ. Além disso, foi avaliado o efeito antiproliferativo da NTZ em células normais, por meio de ensaio de reparação tecidual em camundongos Swiss. Por meio da espectrometria de massas foram identificadas 60 enzimas com critérios de elevada estringência, que podem ter suas atividades alteradas pela NTZ. A modelagem molecular realizada com a NTZ, TIZ e as enzimas Glutathione S-transferase P1 (GSTP1), Glutathione S-transferase M2 (GSTM2), NAD(P)H dehydrogenase [quinone] 1 (NQO1), Fumarylacetoacetase (FAH) e Hydroxysteroid (17-beta) dehydrogenase 10 (17β-HSD10), permitiu a proposição do sítio de ligação dessas enzimas que justificam uma inibição competitiva pela NTZ/TIZ. A modelagem com Protein disulfideisomerase (PDI), permitiu a proposição de uma inibição na PDI humana pela TIZ, por meio do impedimento de estabilização da sua conformação no estado reduzido. Esses resultados colocam a GSTP1, GSTM2, NQO1 e PDI como possíveis alvos dos efeitos antitumorais que foram demonstrados para NTZ, uma vez que estas enzimas são essenciais para manutenção das células tumorais; a FAH como possível alvo de efeitos colaterais em função do acúmulo do seu metabólito tóxico; e a 17β-HSD10 como possível alvo de novas alternativas para o tratamento do Alzheimer, devido ao possível envolvimento dessa enzima no desenvolvimento da doença. Além disso, nossos estudos de reparação tecidual em camundongos tratados com NTZ 10-3M, NTZ 10-5M e NTZ 10-6M, demonstraram macroscopicamente que não houve um efeito modificador da proliferação tecidual que limitasse o fechamento das áreas das feridas, e que microscopicamente o grupo NTZ 10-3M apresentou feridas num grau de maturidade mais avançado, compatível com o estágio proliferativo do processo cicatricial em comparação ao grupo controle. Os resultados desse trabalho corroboram com os mecanismos dos efeitos antitumorais descritos para esse fármaco, interpretam as interações moleculares para auxiliar no desenvolvimento de novas estruturas e sugerem a possibilidade de aplicação no tratamento da doença de Alzheimer.Item Inovações na produção de enzimas do fungo Chrysoporthe cubensis e seus reflexos na sacarificação do bagaço de cana-de-açúcar.(2018) Albuquerque, Mariana Furtado Granato de; Rezende, Sebastião Tavares de; Guimarães, Valéria Monteze; Rezende, Sebastião Tavares de; Almeida, Maíra Nicolau de; Andrade, Milton Hércules Guerra de; Monteiro, Paulo Sérgio; Brandão, Rogélio LopesO presente trabalho avaliou o efeito de métodos de pré-tratamento, ainda não testados, na hidrólise do bagaço de cana realizada com coquetéis enzimáticos fúngicos produzidos on-site. Além disso, o extrato enzimático de C. cubensis foi melhorado, por meio de alterações em suas condições de cultivo, e as enzimas α-arabinofuranosidases desse fungo foram purificadas, caracterizadas e avaliadas na hidrólise do bagaço de cana-de-açúcar pré-tratado alcalino. Os melhores resultados mostraram que o prétratamento hidrotérmico permitiu a conversão de mais de 60% da glicana pelo blend enzimático C. cubensis-P.pinophilum, além de diminuir a necessidade de hemicelulases no processo. O farelo de trigo se destacou, em relação ao capim elefante e ao bagaço de cana-de-açúcar, como fonte de carbono no crescimento do C. cubensis. O melhor extrato enzimático, obtido a partir do crescimento do fungo em uma mistura do farelo de trigo e farinha de beterraba, na proporção 1:1, se mostrou mais completo e eficiente na sacarificação do bagaço de cana submetido ao pré-tratamento ácido ou alcalino, se comparado ao extrato enzimático obtido com farelo de trigo puro. A partir desse coquetel, foram purificadas e caracterizadas duas α-arabinofuranosidases, denominadas α-Ara1 e α-Ara2. As duas enzimas foram satisfatoriamente estáveis a 50 °C, com meiavidas de 68 e 77 horas, respectivamente, e apresentaram pH e temperatura ótimos próximos a 4,0 e 60 °C. A α-Ara1 foi identificada como membro da família GH51 e a αAra2 como uma GH54. Se comparada à α-Ara1, α-Ara2 apresentou maior atividade específica em diferentes substratos, além de maiores eficiências catalíticas ao atuar sobre substratos naturais e complexos, provavelmente devido à presença do domínio de ligação à carboidrato CBM42, presente na estrutura desse enzima. A suplementação do coquetel comercial Multifect® CL com a α-Ara2 aumentou 1,6 vezes e liberação de glicose e 3,6 vezes a produção de xilose. Resultado idêntico foi observado após a combinação do coquetel comercial com as duas α-arabinofuranosidases purificadas, o que indicou sinergismo entre as mesmas. Portanto, o presente estudo contribui para maior conhecimento dos efeitos de diferentes pré-tratamentos na atuação das enzimas produzidas por C. cubensis, bem como traz algumas inovações relacionadas ao processo de produção de enzimas desse fungo e ao estudo de novas α-arabinofuranosidases com potencial para aplicação na indústria de etanol lignocelulósico.Item Parâmetros epigenéticos e parasitológicos associados à esquistossomose mansônica em camundongos C57BL/6 EBi3-/-.(2020) Mota, Ester Alves; Cota, Renata Guerra de Sá; Cota, Renata Guerra de Sá; Babá, Élio Hideo; Cabral, Fernanda Janku; Andrade, Milton Hércules Guerra de; Soares, Rodrigo Dian de Oliveira AguiarA hipótese desse trabalho é que o parasito Schistosoma mansoni em resposta ao sistema imune do hospedeiro mamífero altera seu estado epigenético e modula o estado epigenético do hospedeiro definitivo, e consequentemente a extensão do granuloma hepático. Para investigar essa hipótese foi utilizada a infecção em modelo murino C57BL/6 EBi3-/- e delineados os objetivos específicos: (i) a investigação dos efeitos parasitológicos; (ii) se o parasito modularia mecanismos epigenéticos no hospedeiro; (iii) se o hospedeiro poderia afetar a expressão de genes relacionados a mecanismos epigenéticos do parasito; (iv) avaliar a expressão de miRNAs e lncRNAs de S. mansoni no modelo C57BL/6 EBi3-/- bem como o potencial desses ncRNAs como biomarcadores (v) avaliar a expressão de genes relacionados a epigenética na cepa LE do S. mansoni resistente ao praziquantel (LE-PZQ). Foram utilizados camundongos C57BL/6 WTC (selvagem controle), WTI (selvagem infectado), EBi3-/-C (nocaute controle) e EBi3-/- I ( nocaute infectado) todos com 55 dias de infecção, 100 cercárias. Nos experimentos com S. mansoni, foram utilizados pool de parasitos recuperados de camundongos WT (LE-controle), cepa LE-PZQ e recuperados de EBi3-/- (LE de EBi3-/- ). Os resultados mostram que a esquistossomose murina no modelo C57BL/6 EBi3-/- I apresenta uma diminuição no dano hepático, no volume e número dos granulomas e quantidade de ovos nas fezes em relação ao observado no grupo WTI, (p<0,05) A demetilação do DNA está mais ativa que a metilação em todos os grupos devido ao maior nível de expressão das TETs em comparação com a expressão das DNMTs, sendo que, quanto maior o número de granulomas, menor a expressão de TET3 e DNMT1 em EBi3-/- I (p<0,05) A infecção por S. mansoni induz uma diminuição no conteúdo de metilação global do DNA. Os vermes adultos machos, recuperados do modelo C57BL/6 EBi3-/- apresentaram uma diminuição no conteúdo de metilação global do DNA comparando com o macho controle, bem como diminuição na expressão de SmUSPs 7, 22, 46 e 49, o que pode afetar o turnover da via ubiquitinaproteassoma e alterar o padrão de ubiquitinação nas histonas. Já na cepa LE-PZQ o SmUSP15 foi o único gene up regulado em machos. Verificamos também que os miRNAs 190 e 125A possuem função sexo-específica em S. mansoni, o miR-190-3p foi o único encontrado no plasma de C57BL/6 EBi3-/- I. Os lncRNA5 6 e 7 foram detectados no plasma de C57BL/6 EBi3-/- . Os dados indicam uma modulação epigenética do hospedeiro mamífero no parasito e abrem perspectivas para a influência epigenética na interação parasito-hospedeiro.Item Peptídeos antigênicos indutores de anticorpos específicos para identificação de alterações de maior prevalência do subtipo 2B da doença de von Willebrand e do fator de von Willebrand normal.(2012) Paro, Marina de Oliveira; Andrade, Milton Hércules Guerra deA doença de Von Willebrand (DVW) é um distúrbio hemorrágico hereditário de caráter autossômico dominante ou recessivo, ocasionado por defeitos quantitativos ou qualitativos do fator de Von Willebrand (FVW). Trata-se da coagulopatia hereditária mais comum na população humana, com prevalência de 1,3% da população. Os defeitos qualitativos são divididos em quatro subtipos (2A, 2B, 2M e 2N) de acordo com a alteração da função do FVW. A classificação dos diversos tipos de DVW se apóia em vários métodos de avaliação da função e da quantidade do FVW, o que dificulta esse diagnóstico tornando-o passível de erros. Diante das dificuldades atuais para o diagnóstico da DVW relacionadas às alterações qualitativas do FVW, esse trabalho apresenta como proposta o emprego de estratégias bioquímicas para a identificação de alterações na estrutura do FVW. Para se desenvolver métodos de isolamento do FvW que utilizem pequenos volumes de amostras de sangue para preparação de amostras para espectrometria de massas, alíquotas de plasma humano passaram por processo de precipitação por etanol e foram tratadas em colunas de gelatina para remover a fibronectina do FVW para isolá-lo como único componente em uma banda de 250 KDa, visando reduzir a possibilidade de supressão provocada por impurezas na espectrometria de massas. Mediante a análise da estrutura cristalográfica, com auxílio de ferramenta computacional, foram definidos 22 peptídeos correspondentes a sequência de aminoácidos encontradas no FVW normal e alterado presentes na DVW tipo 2A, 2B e 2M. Esses peptídeos foram utilizados na obtenção de anticorpos a partir da imunização de camundongos e na purificação dos mesmos em colunas de afinidade. Obtiveram-se quatro preparações anticorpos purificadas para alterações do tipo 2B com prevalência de 90%, além de três preparações de anticorpos purificados para o FVW normal. A obtenção desses anticorpos específicos para o FVW permitirá o uso dos mesmos em análises de multímeros no teste de diagnóstico, atualmente empregado na classificação de DVW, ensaios de capacidade de ligação ao fator VIII e produção de anticorpos monoclonais específicos.Item Produção, purificação e caracterização de uma poligalacturonase do Chrysoporthe cubensis.(2016) Barreto, Elisa da Silva; Guimarães, Valéria Monteze; Andrade, Milton Hércules Guerra de; Queiróz, José Humberto deOs objetivos deste trabalho foram cultivar o fungo Chrysoporthe cubensis em diferentes fontes de carbono de baixo custo, para induzir a produção da poligalacturonase, purificar e caracterizar a enzima, para identificar propriedades funcionais interessantes para possíveis aplicações biotecnológicas. O fungo foi cultivado em meio semi sólido (67% de umidade), com farelo de trigo, casca de maracujá e casca de laranja, além disso os resíduos de frutas foram misturados ao farelo nas proporções 1:1, 3:1 e 9:1 (farelo: resíduo de fruta). O fungo apresentou maior produção da poligalacturonase em meio composto por farelo de trigo e casca de maracujá (3:1), com atividade de 41.49 U/g de substrato, sendo 1,32 vezes maior do que no cultivo em farelo de trigo puro. O extrato enzimático bruto foi purificado a partir da cromatografia de troca iônica DEAE-Sepharose, seguida por cromatografia em gel filtração em coluna Sephacryl S-200, exibindo atividade específica de 1117,45U/mg, com aumento de 28,34 vezes e rendimento final de 29,2 %. A massa molecular da poligalacturonase, obtida através de SDS-PAGE 12% foi de, aproximadamente, 40,74Kd. A enzima apresentou pH e temperatura ótimos de 3,5 e 50°C, repectivamente, e meia vida de 4,05 minutos a 50°C. A enzima se manteve estável na faixa de pH de 2,5 a 8,5, apresentando acima de 80% da atividade após 1h. O substrato preferencial da enzima foi o ácido poligalacturônico e o km e Vmax foi de 0,766 mg.mL-1 e 1,88U/mL, respectivamente. Os resultados obtidos neste trabalho indicam que a PG de C. cubensis é uma enzima importante dentro do complexo hidrolítico secretado pelo fungo quando cultivado em SSF, em meio contendo resíduos agroindustriais.Item Serratia marcescens resistente ao manganês e estratégias para biorremediação de ambientes contaminados.(2018) Queiroz, Pollyana Santos; Cota, Renata Guerra de Sá; Góes Neto, Aristóteles; Cota, Renata Guerra de Sá; Babá, Élio Hideo; Andrade, Milton Hércules Guerra deO manganês (II) solúvel que tem sido associado a uma crescente contaminação de corpos aquáticos e problemas de saúde humana devido à sua toxicidade. Na busca por estratégias ecologicamente adequadas para a sua remoção, podemos destacar os isolados de Serratia marcescens, que teve seu o potencial demonstrado na remoção de altas concentrações desse metal. Como forma de melhorar a eficiência de remoção de Mn (II) dessa espécie, um meio de cultura rico em nutrientes (meio NB) suplementado com Mn (II) foi comparado com um meio pobre em nutrientes (meio K) para avaliar a sua influência no processo de remoção por duas diferentes cepas, uma não pigmentada (CL11) e outra pigmentada (LG1) que ainda não tinha sido estudada. Uma vez que um meio rico pode favorecer um maior crescimento bacteriano, uma maior remoção de Mn (II) pode ocorrer. No meio NB, a cepa LG1 e a cepa CL11 exibiram um melhor crescimento e maior tolerância ao Mn (II) (0-2000 mg L − 1). Além disso, uma melhor remoção de Mn (II) (64,25%) e o aumento da formação de óxidos de Mn foram observados neste meio, especialmente para o isolado LG1. A análise de EELS revelou Mn no interior da célula de LG1 e a análise de EDX revelou Mn fora da célula de CL11, indicando que as duas cepas removem Mn (II) através de mecanismos distintos. A bioxidação de Mn pelo isolado CL11 parece envolver mecanismos indiretos que alteram o pH do meio, enquanto o isolado LG1 parece usar um mecanismo direto para a biooxidação mediada por componentes celulares, como proteínas intracelulares. É a primeira vez que o alto potencial do meio NB para remoção de Mn é demonstrado. Este meio influenciou em uma melhor remoção de Mn e na formação de óxidos, especialmente no caso do isolado LG1 pigmentado. Como a cepa LG1 apresentou um potencial diferenciado na bio-oxidação de Mn (II), o seu foi proteoma foi analisado na ausência e presença de Mn (II) através da abordagem shotgun, para obter informações sobre como as bactérias respondem a esse metal e identificar as proteínas envolvidas na sua oxidação. A cepa LG1, que cresceu igualmente bem nas duas condições, expressou um conjunto de proteínas relacionadas aos processos celulares vitais para a sobrevivência, bem como proteínas envolvidas na adaptação e tolerância ao Mn (II). A multicobre oxidase CueO foi identificada, indicando sua provável participação na bioxidação de Mn (II), no entanto, sua expressão não foi modulada pela presença desse metal. Um conjunto de proteínas relacionadas aos processos celulares e metabólicos vitais para as células foram reguladas negativamente na presença de Mn (II), enquanto as proteínas relacionadas à membrana celular envolvidas na manutenção da integridade celular e sobrevivência sob estresse foram upreguladas sob essa condição. Este estudo permitiu obter o primeiro proteoma total dessa espécie nas condições de ausência de presença de Mn (II). O pigmento prodigiosina sintetizado pela cepa LG1 foi caracterizado e foi possível observar o efeito de elevadas concentrações de Mn (II) na sua produção e o seu efeito protetor para a cepa nessas condições. Entretanto é necessário estudar a relação direta da prodigiosina com a remoção de Mn (II). Em conjuntos, estes resultados demonstram o potencial biotecnológico de isolados de S. marcescens na biorremediação de Mn (II) e sugerimos a sua utilização juntamente com o meio NB em grandes biorreatores contínuos para o tratamento de efluentes contaminados com Mn. Além disso, a lista de proteínas expressas identificadas pela análise proteômica pode ser usada como uma ferramenta em experimentos futuros para validar esses achados.Item Síntese de peptídeos ricos em prolina e arginina e atividade inibitória sobre o complexo proteolítico proteassoma 20s de mamíferos e do parasito Schistosoma mansoni.(Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós Graduação, Universidade Federal de Ouro Preto., 2012) Breguez, Gustavo Silveira; Andrade, Milton Hércules Guerra deO proteassoma tem sido considerado um potencial alvo farmacológico devido ao seu envolvimento em processos vitais relacionados à proteólise celular, sendo a mais importante entre as vias de degradação. Recentemente, foi demonstrado que moléculas análogas ao peptídeo PR-11(RRRPRPPYLPR), que corresponde aos 11 primeiros aminoácidos da porção N-terminal do peptídeo PR-39, apresentam uma forte inibição sobre o proteassoma humano 20S, inibindo a atividade quimotripsina-símile em concentrações namolares (nM). Os peptídeos dessa classe desempenham importantes atividades anti-inflamatórias e angiogênicas. Novas moléculas envolvendo substituições conservativas de aminoácidos e sínteses de peptídeos cíclicos podem ser derivadas dessas estruturas, com o intuito de se encontrar melhores inibidores. Dessa forma, este trabalho teve como objetivos a síntese do peptídeo PR-11 e análogos para a realização de ensaios de atividade peptidásica in vitro, visando verificar o potencial inibitório dos peptídeos sintetizados em frações enriquecidas com proteassoma 20S de fígado de camundongos Swiss, eritrócitos humanos e vermes adultos de Schistosoma mansoni. Os peptídeos foram sintetizados empregando-se a estratégia Fmoc em fase sólida, purificados em sistema HPLC e identificados por espectrometria de massas. As frações com proteassoma 20S foram obtidas a partir de cromatografias de filtração molecular em Sephacryl S-400, as quais permitiram preparar satisfatoriamente enriquecidos de proteassoma livres de proteases de baixa massa molecular. Todos os análogos foram capazes de inibir a atividade quimotripsina-símile in vitro do proteassoma 20S das três espécies estudadas, utilizando a concentração final de 1μM de peptídeo. De um modo geral, as intensidades das atividades inibitórias foram similares para o proteassoma 20S de camundongos e humanos e menores para o de vermes adultos de Schistosoma mansoni. Os análogos cíclicos C8C15 e C9C15, quando comparados ao PR-11, apresentaram menor atividade sobre o proteassoma de humanos e atividade similar quanto à inibição em Schistosoma mansoni. Tal fato sugere que esse tipo de alteração estrutural possa ser útil na busca por inibidores mais seletivos para o proteassoma 20S do parasito.