PPBIOTEC - Doutorado (Teses)

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Análise de QTL e gênomica comparativa para estudar mecanismos regulatórios da H+ -ATPASE de membrana plasmática de Saccharomyces cerevisiae.
(2021) Barbosa, Patrícia Gonçalves Prates; Brandão, Rogélio Lopes; Cunha, Aureliano Claret da; Cruz, Izinara Rosse da; Brandão, Rogélio Lopes; Fietto, Luciano Gomes; Mendes, Tiago Antônio de Oliveira; Andrade, Milton Hércules Guerra de; Silva, Silvana de Queiroz
A H+ -ATPase é uma proteína presente na membrana citoplasmática de plantas e fungos e desempenha um papel essencial na geração de um gradiente eletroquímico de prótons, importante para a captação de nutrientes e regulação do pH intracelular. A ativação da H + -ATPase da membrana citoplasmática em Saccharomyces cerevisiae induzida por glicose é supostamente atribuída a um sinal de cálcio intracelular correlacionado ao metabolismo do fosfatidilinositol. Em estudos anteriores do nosso grupo de pesquisa, foi observada diferença de fenótipo entre as cepas S. cerevisiae BY4742 arg82Δ e PJ69 arg82Δ através do teste de atividade da H + -ATPase, indicando que o fenótipo de maior ativação da H + -ATPase está relacionado a vários genes. Diante do exposto, o objetivo deste trabalho foi utilizar diferentes abordagens genômicas para identificar novos componentes da regulação induzida por glicose da H + -ATPase. Para isso, foram realizados o sequenciamento do genoma segregante agrupado, mapeamento de QTLs e análises de Bioinformática para identificar o possível motivo da diferença de fenótipo e, ou, novos componentes desta via de transdução de sinal. Uma vez identificadas as variantes na análise de mapeamento de QTL foi desenvolvido o script SNPsInQTLselection.py para identificar as bases genéticas que podem estar envolvidas com o fenótipo de maior atividade da H+ -ATPase. Após a utilização desse script foram identificadas 42 variantes em 33 genes potencialmente envolvidos com o fenótipo de interesse. Para priorização desses genes candidatos foi realizado análise de enriquecimento e interatoma que permitiram identificar 10 genes enriquecidos e envolvidos na via da telomerase e do fosfatidilinositol (STT4, PIK2, UGA2, EST1, MEC3, HEK2, TOP3, PSO2, STO1, FUR4). Cepas do background BY contendo essesrespectivos genes deletados (coleção EUROSCARF) foram utilizadas para teste de fenótipo de acidificação extracelular e sinalização de cálcio induzida por glicose. Por meio desses testes, 4 (UGA2, FUR4, EST1 e STT4) dos 10 genes enriquecidos, apresentaram o fenótipo de maior ativação da H+ -ATPase, fenótipo esse evidenciado nos testes de acidificação extracelular e sinal de cálcio. Destes 4 genes, vale destacar o STT4 visto que, de acordo com a função descrita para esse gene na literatura o fosfatidilinositol-4-fosfato pode exercer um papel na regulação da via de ativação de H + -ATPase, controlando a atividade da fosfolipase C. Tendo em vista uma relação positiva entre atividade da H + - ATPase e desempenho fermentativo, estudos futuros podem ser feitos com os genes/alelos identificados neste trabalho, com aplicação em cepas de leveduras industriais visando a melhoria na eficiência de processos fermentativos. Os genes (UGA2, FUR4, EST1 e STT4) merecem investigação detalhada para verificação do possível envolvimento na via de sinalização da H+ -ATPase. Esse trabalho apresenta pela primeira vez uma estratégia de Bioinformática para identificar genes candidatos quando o resultado do mapeamento de QTL não for significativo.
Análises de QTL e genômica comparativa para estudar mecanismos regulatórios da H+-ATPase de membrana.
(2021) Barbosa, Patrícia Gonçalves Prates; Brandão, Rogélio Lopes; Cunha, Aureliano Claret da; Cruz, Izinara Rosse da; Brandão, Rogélio Lopes; Fietto, Luciano Gomes; Mendes, Tiago Antônio de Oliveira; Andrade, Milton Hércules Guerra de; Silva, Silvana de Queiroz
A H+ -ATPase é uma proteína presente na membrana citoplasmática de plantas e fungos e desempenha um papel essencial na geração de um gradiente eletroquímico de prótons, importante para a captação de nutrientes e regulação do pH intracelular. A ativação da H + -ATPase da membrana citoplasmática em Saccharomyces cerevisiae induzida por glicose é supostamente atribuída a um sinal de cálcio intracelular correlacionado ao metabolismo do fosfatidilinositol. Em estudos anteriores do nosso grupo de pesquisa, foi observada diferença de fenótipo entre as cepas S. cerevisiae BY4742 arg82Δ e PJ69 arg82Δ através do teste de atividade da H + -ATPase, indicando que o fenótipo de maior ativação da H + -ATPase está relacionado a vários genes. Diante do exposto, o objetivo deste trabalho foi utilizar diferentes abordagens genômicas para identificar novos componentes da regulação induzida por glicose da H + -ATPase. Para isso, foram realizados o sequenciamento do genoma segregante agrupado, mapeamento de QTLs e análises de Bioinformática para identificar o possível motivo da diferença de fenótipo e, ou, novos componentes desta via de transdução de sinal. Uma vez identificadas as variantes na análise de mapeamento de QTL foi desenvolvido o script SNPsInQTLselection.py para identificar as bases genéticas que podem estar envolvidas com o fenótipo de maior atividade da H+ -ATPase. Após a utilização desse script foram identificadas 42 variantes em 33 genes potencialmente envolvidos com o fenótipo de interesse. Para priorização desses genes candidatos foi realizado análise de enriquecimento e interatoma que permitiram identificar 10 genes enriquecidos e envolvidos na via da telomerase e do fosfatidilinositol (STT4, PIK2, UGA2, EST1, MEC3, HEK2, TOP3, PSO2, STO1, FUR4). Cepas do background BY contendo essesrespectivos genes deletados (coleção EUROSCARF) foram utilizadas para teste de fenótipo de acidificação extracelular e sinalização de cálcio induzida por glicose. Por meio desses testes, 4 (UGA2, FUR4, EST1 e STT4) dos 10 genes enriquecidos, apresentaram o fenótipo de maior ativação da H+ -ATPase, fenótipo esse evidenciado nos testes de acidificação extracelular e sinal de cálcio. Destes 4 genes, vale destacar o STT4 visto que, de acordo com a função descrita para esse gene na literatura o fosfatidilinositol-4-fosfato pode exercer um papel na regulação da via de ativação de H + -ATPase, controlando a atividade da fosfolipase C. Tendo em vista uma relação positiva entre atividade da H + - ATPase e desempenho fermentativo, estudos futuros podem ser feitos com os genes/alelos identificados neste trabalho, com aplicação em cepas de leveduras industriais 8 visando a melhoria na eficiência de processos fermentativos. Os genes (UGA2, FUR4, EST1 e STT4) merecem investigação detalhada para verificação do possível envolvimento na via de sinalização da H+ -ATPase. Esse trabalho apresenta pela primeira vez uma estratégia de Bioinformática para identificar genes candidatos quando o resultado do mapeamento de QTL não for significativo.
Análises genômicas para otimização da produção de compostos aromatizantes por estirpe de Saccharomyces cerevisiae isolada de produção de cachaça.
(2018) Araújo, Thalita Macedo; Brandão, Rogélio Lopes; Diniz, Raphael Hermano Santos; Mendes, Tiago Antônio de Oliveira; Borges, William de Castro; Fietto, Luciano Gomes; Brandão, Rogélio Lopes; Andrade, Milton Hércules Guerra de
A qualidade das bebidas alcoólicas está intimamente relacionada à presença de concentrações equilibradas de compostos voláteis, subprodutos do processo de fermentação alcoólica e altamente influenciados pela linhagem da levedura utilizada de tal modo que a compreensão das bases moleculares da produção de compostos desejáveis represente a possibilidade do incremento da qualidade de bebidas fermentadas visando a agregação de valor ao produto final. O presente trabalho tem como objetivo realizar uma análise de características genéticas e fisiológicas das leveduras isoladas da produção de cachaça com potencial para aplicação na produção de outras bebidas alcoólicas. Desse modo, 118 linhagens da coleção LBCM foram avaliadas quanto a capacidade de metabolização de maltose, produção de baixas concentrações de sulfeto de hidrogênio, capacidade de transporte de maltotriose e capacidade de produção de compostos voláteis. A despeito de sua origem comum, as leveduras avaliadas apresentaram diferenças significativas em sua fisiologia. Algumas dessas leveduras apresentam potencial biológico para aplicação na produção de outras bebidas, como, por exemplo, cerveja. A linhagem LBCM1073 foi selecionada dentre as demais por ser heterotálica e pela sua capacidade de produção de acetato de isoamila, um éster altamente desejável em diversas bebidas alcoólicas. Após sequenciamento genômico dessa levedura, com cobertura de 263 vezes e a predição de 5686 genes, análises de genômica comparativa revelaram que a linhagem LBCM1073 apresenta um conjunto de 24 genes ausentes na linhagem laboratorial S. cerevisiae S288c. Alguns desses genes apresentam similaridade com S. bayanus e Lachancea sp. Um total de 64,15% dos genes da linhagem LBCM1073 apresenta ortólogos com genes de 40 ascomicetos avaliados. Dentre as vias já mencionadas na literatura como relacionadas à produção de compostos voláteis, a via de sinalização mTOR e a glicólise, são as que apresentaram maior percentual de genes ortólogos, justificado pela ampla distribuição dessas duas vias dentre os organismos utilizados para análise. Ao serem comparadas as sequências de aminoácidos de 34 enzimas,relacionadas à produção de compostos responsáveis por aromas, 13 foram idênticas entre LBCM1073 e S. cerevisiae S288c. Para as demais, as proteínas codificadas por LEU4, PMA1, RSP5, TOR1 e FAS2 não apresentaram as substituições descritas na literatura como relacionadas à maior produção de compostos on flavour. Em conjunto, esses dados mostram que LBCM1073 e S. cerevisiae S288c apresentam diversas distinções a nível genômico. Uma metodologia capaz de contribuir para melhor elucidar essas diferenças em relação à produção de compostos secundários à fermentação é a técnica de BSA (Bulked Segregants Analisys) ou análise de agrupamentos de segregantes. As análises fenotípicas de segregantes obtidos do cruzamento entre LBCM1073 e S. cerevisiae S288c revelou uma discreta relação direta entre a capacidade de conversão de álcool isoamílico em acetato de isoamila e o crescimento na presença de TFL 0,5 mM. Além disso, os segregantes já obtidos e avaliados poderão ser empregados na análise de QTLs envolvidos na produção de acetato de isoamila.
Inovações na produção de enzimas do fungo Chrysoporthe cubensis e seus reflexos na sacarificação do bagaço de cana-de-açúcar.
(2018) Albuquerque, Mariana Furtado Granato de; Rezende, Sebastião Tavares de; Guimarães, Valéria Monteze; Rezende, Sebastião Tavares de; Almeida, Maíra Nicolau de; Andrade, Milton Hércules Guerra de; Monteiro, Paulo Sérgio; Brandão, Rogélio Lopes
O presente trabalho avaliou o efeito de métodos de pré-tratamento, ainda não testados, na hidrólise do bagaço de cana realizada com coquetéis enzimáticos fúngicos produzidos on-site. Além disso, o extrato enzimático de C. cubensis foi melhorado, por meio de alterações em suas condições de cultivo, e as enzimas α-arabinofuranosidases desse fungo foram purificadas, caracterizadas e avaliadas na hidrólise do bagaço de cana-de-açúcar pré-tratado alcalino. Os melhores resultados mostraram que o prétratamento hidrotérmico permitiu a conversão de mais de 60% da glicana pelo blend enzimático C. cubensis-P.pinophilum, além de diminuir a necessidade de hemicelulases no processo. O farelo de trigo se destacou, em relação ao capim elefante e ao bagaço de cana-de-açúcar, como fonte de carbono no crescimento do C. cubensis. O melhor extrato enzimático, obtido a partir do crescimento do fungo em uma mistura do farelo de trigo e farinha de beterraba, na proporção 1:1, se mostrou mais completo e eficiente na sacarificação do bagaço de cana submetido ao pré-tratamento ácido ou alcalino, se comparado ao extrato enzimático obtido com farelo de trigo puro. A partir desse coquetel, foram purificadas e caracterizadas duas α-arabinofuranosidases, denominadas α-Ara1 e α-Ara2. As duas enzimas foram satisfatoriamente estáveis a 50 °C, com meiavidas de 68 e 77 horas, respectivamente, e apresentaram pH e temperatura ótimos próximos a 4,0 e 60 °C. A α-Ara1 foi identificada como membro da família GH51 e a αAra2 como uma GH54. Se comparada à α-Ara1, α-Ara2 apresentou maior atividade específica em diferentes substratos, além de maiores eficiências catalíticas ao atuar sobre substratos naturais e complexos, provavelmente devido à presença do domínio de ligação à carboidrato CBM42, presente na estrutura desse enzima. A suplementação do coquetel comercial Multifect® CL com a α-Ara2 aumentou 1,6 vezes e liberação de glicose e 3,6 vezes a produção de xilose. Resultado idêntico foi observado após a combinação do coquetel comercial com as duas α-arabinofuranosidases purificadas, o que indicou sinergismo entre as mesmas. Portanto, o presente estudo contribui para maior conhecimento dos efeitos de diferentes pré-tratamentos na atuação das enzimas produzidas por C. cubensis, bem como traz algumas inovações relacionadas ao processo de produção de enzimas desse fungo e ao estudo de novas α-arabinofuranosidases com potencial para aplicação na indústria de etanol lignocelulósico.
Parâmetros epigenéticos e parasitológicos associados à esquistossomose mansônica em camundongos C57BL/6 EBi3-/-.
(2020) Mota, Ester Alves; Cota, Renata Guerra de Sá; Cota, Renata Guerra de Sá; Babá, Élio Hideo; Cabral, Fernanda Janku; Andrade, Milton Hércules Guerra de; Soares, Rodrigo Dian de Oliveira Aguiar
A hipótese desse trabalho é que o parasito Schistosoma mansoni em resposta ao sistema imune do hospedeiro mamífero altera seu estado epigenético e modula o estado epigenético do hospedeiro definitivo, e consequentemente a extensão do granuloma hepático. Para investigar essa hipótese foi utilizada a infecção em modelo murino C57BL/6 EBi3-/- e delineados os objetivos específicos: (i) a investigação dos efeitos parasitológicos; (ii) se o parasito modularia mecanismos epigenéticos no hospedeiro; (iii) se o hospedeiro poderia afetar a expressão de genes relacionados a mecanismos epigenéticos do parasito; (iv) avaliar a expressão de miRNAs e lncRNAs de S. mansoni no modelo C57BL/6 EBi3-/- bem como o potencial desses ncRNAs como biomarcadores (v) avaliar a expressão de genes relacionados a epigenética na cepa LE do S. mansoni resistente ao praziquantel (LE-PZQ). Foram utilizados camundongos C57BL/6 WTC (selvagem controle), WTI (selvagem infectado), EBi3-/-C (nocaute controle) e EBi3-/- I ( nocaute infectado) todos com 55 dias de infecção, 100 cercárias. Nos experimentos com S. mansoni, foram utilizados pool de parasitos recuperados de camundongos WT (LE-controle), cepa LE-PZQ e recuperados de EBi3-/- (LE de EBi3-/- ). Os resultados mostram que a esquistossomose murina no modelo C57BL/6 EBi3-/- I apresenta uma diminuição no dano hepático, no volume e número dos granulomas e quantidade de ovos nas fezes em relação ao observado no grupo WTI, (p<0,05) A demetilação do DNA está mais ativa que a metilação em todos os grupos devido ao maior nível de expressão das TETs em comparação com a expressão das DNMTs, sendo que, quanto maior o número de granulomas, menor a expressão de TET3 e DNMT1 em EBi3-/- I (p<0,05) A infecção por S. mansoni induz uma diminuição no conteúdo de metilação global do DNA. Os vermes adultos machos, recuperados do modelo C57BL/6 EBi3-/- apresentaram uma diminuição no conteúdo de metilação global do DNA comparando com o macho controle, bem como diminuição na expressão de SmUSPs 7, 22, 46 e 49, o que pode afetar o turnover da via ubiquitinaproteassoma e alterar o padrão de ubiquitinação nas histonas. Já na cepa LE-PZQ o SmUSP15 foi o único gene up regulado em machos. Verificamos também que os miRNAs 190 e 125A possuem função sexo-específica em S. mansoni, o miR-190-3p foi o único encontrado no plasma de C57BL/6 EBi3-/- I. Os lncRNA5 6 e 7 foram detectados no plasma de C57BL/6 EBi3-/- . Os dados indicam uma modulação epigenética do hospedeiro mamífero no parasito e abrem perspectivas para a influência epigenética na interação parasito-hospedeiro.
Serratia marcescens resistente ao manganês e estratégias para biorremediação de ambientes contaminados.
(2018) Queiroz, Pollyana Santos; Cota, Renata Guerra de Sá; Góes Neto, Aristóteles; Cota, Renata Guerra de Sá; Babá, Élio Hideo; Andrade, Milton Hércules Guerra de
O manganês (II) solúvel que tem sido associado a uma crescente contaminação de corpos aquáticos e problemas de saúde humana devido à sua toxicidade. Na busca por estratégias ecologicamente adequadas para a sua remoção, podemos destacar os isolados de Serratia marcescens, que teve seu o potencial demonstrado na remoção de altas concentrações desse metal. Como forma de melhorar a eficiência de remoção de Mn (II) dessa espécie, um meio de cultura rico em nutrientes (meio NB) suplementado com Mn (II) foi comparado com um meio pobre em nutrientes (meio K) para avaliar a sua influência no processo de remoção por duas diferentes cepas, uma não pigmentada (CL11) e outra pigmentada (LG1) que ainda não tinha sido estudada. Uma vez que um meio rico pode favorecer um maior crescimento bacteriano, uma maior remoção de Mn (II) pode ocorrer. No meio NB, a cepa LG1 e a cepa CL11 exibiram um melhor crescimento e maior tolerância ao Mn (II) (0-2000 mg L − 1). Além disso, uma melhor remoção de Mn (II) (64,25%) e o aumento da formação de óxidos de Mn foram observados neste meio, especialmente para o isolado LG1. A análise de EELS revelou Mn no interior da célula de LG1 e a análise de EDX revelou Mn fora da célula de CL11, indicando que as duas cepas removem Mn (II) através de mecanismos distintos. A bioxidação de Mn pelo isolado CL11 parece envolver mecanismos indiretos que alteram o pH do meio, enquanto o isolado LG1 parece usar um mecanismo direto para a biooxidação mediada por componentes celulares, como proteínas intracelulares. É a primeira vez que o alto potencial do meio NB para remoção de Mn é demonstrado. Este meio influenciou em uma melhor remoção de Mn e na formação de óxidos, especialmente no caso do isolado LG1 pigmentado. Como a cepa LG1 apresentou um potencial diferenciado na bio-oxidação de Mn (II), o seu foi proteoma foi analisado na ausência e presença de Mn (II) através da abordagem shotgun, para obter informações sobre como as bactérias respondem a esse metal e identificar as proteínas envolvidas na sua oxidação. A cepa LG1, que cresceu igualmente bem nas duas condições, expressou um conjunto de proteínas relacionadas aos processos celulares vitais para a sobrevivência, bem como proteínas envolvidas na adaptação e tolerância ao Mn (II). A multicobre oxidase CueO foi identificada, indicando sua provável participação na bioxidação de Mn (II), no entanto, sua expressão não foi modulada pela presença desse metal. Um conjunto de proteínas relacionadas aos processos celulares e metabólicos vitais para as células foram reguladas negativamente na presença de Mn (II), enquanto as proteínas relacionadas à membrana celular envolvidas na manutenção da integridade celular e sobrevivência sob estresse foram upreguladas sob essa condição. Este estudo permitiu obter o primeiro proteoma total dessa espécie nas condições de ausência de presença de Mn (II). O pigmento prodigiosina sintetizado pela cepa LG1 foi caracterizado e foi possível observar o efeito de elevadas concentrações de Mn (II) na sua produção e o seu efeito protetor para a cepa nessas condições. Entretanto é necessário estudar a relação direta da prodigiosina com a remoção de Mn (II). Em conjuntos, estes resultados demonstram o potencial biotecnológico de isolados de S. marcescens na biorremediação de Mn (II) e sugerimos a sua utilização juntamente com o meio NB em grandes biorreatores contínuos para o tratamento de efluentes contaminados com Mn. Além disso, a lista de proteínas expressas identificadas pela análise proteômica pode ser usada como uma ferramenta em experimentos futuros para validar esses achados.