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Análise de QTL e gênomica comparativa para estudar mecanismos regulatórios da H+ -ATPASE de membrana plasmática de Saccharomyces cerevisiae.
(2021) Barbosa, Patrícia Gonçalves Prates; Brandão, Rogélio Lopes; Cunha, Aureliano Claret da; Cruz, Izinara Rosse da; Brandão, Rogélio Lopes; Fietto, Luciano Gomes; Mendes, Tiago Antônio de Oliveira; Andrade, Milton Hércules Guerra de; Silva, Silvana de Queiroz
A H+ -ATPase é uma proteína presente na membrana citoplasmática de plantas e fungos e desempenha um papel essencial na geração de um gradiente eletroquímico de prótons, importante para a captação de nutrientes e regulação do pH intracelular. A ativação da H + -ATPase da membrana citoplasmática em Saccharomyces cerevisiae induzida por glicose é supostamente atribuída a um sinal de cálcio intracelular correlacionado ao metabolismo do fosfatidilinositol. Em estudos anteriores do nosso grupo de pesquisa, foi observada diferença de fenótipo entre as cepas S. cerevisiae BY4742 arg82Δ e PJ69 arg82Δ através do teste de atividade da H + -ATPase, indicando que o fenótipo de maior ativação da H + -ATPase está relacionado a vários genes. Diante do exposto, o objetivo deste trabalho foi utilizar diferentes abordagens genômicas para identificar novos componentes da regulação induzida por glicose da H + -ATPase. Para isso, foram realizados o sequenciamento do genoma segregante agrupado, mapeamento de QTLs e análises de Bioinformática para identificar o possível motivo da diferença de fenótipo e, ou, novos componentes desta via de transdução de sinal. Uma vez identificadas as variantes na análise de mapeamento de QTL foi desenvolvido o script SNPsInQTLselection.py para identificar as bases genéticas que podem estar envolvidas com o fenótipo de maior atividade da H+ -ATPase. Após a utilização desse script foram identificadas 42 variantes em 33 genes potencialmente envolvidos com o fenótipo de interesse. Para priorização desses genes candidatos foi realizado análise de enriquecimento e interatoma que permitiram identificar 10 genes enriquecidos e envolvidos na via da telomerase e do fosfatidilinositol (STT4, PIK2, UGA2, EST1, MEC3, HEK2, TOP3, PSO2, STO1, FUR4). Cepas do background BY contendo essesrespectivos genes deletados (coleção EUROSCARF) foram utilizadas para teste de fenótipo de acidificação extracelular e sinalização de cálcio induzida por glicose. Por meio desses testes, 4 (UGA2, FUR4, EST1 e STT4) dos 10 genes enriquecidos, apresentaram o fenótipo de maior ativação da H+ -ATPase, fenótipo esse evidenciado nos testes de acidificação extracelular e sinal de cálcio. Destes 4 genes, vale destacar o STT4 visto que, de acordo com a função descrita para esse gene na literatura o fosfatidilinositol-4-fosfato pode exercer um papel na regulação da via de ativação de H + -ATPase, controlando a atividade da fosfolipase C. Tendo em vista uma relação positiva entre atividade da H + - ATPase e desempenho fermentativo, estudos futuros podem ser feitos com os genes/alelos identificados neste trabalho, com aplicação em cepas de leveduras industriais visando a melhoria na eficiência de processos fermentativos. Os genes (UGA2, FUR4, EST1 e STT4) merecem investigação detalhada para verificação do possível envolvimento na via de sinalização da H+ -ATPase. Esse trabalho apresenta pela primeira vez uma estratégia de Bioinformática para identificar genes candidatos quando o resultado do mapeamento de QTL não for significativo.
Análise proteômica dos alvos ligantes de niclosamida em extrato solúvel de Limnoperna fortunei Dunker, 1857.
(2023) Nilsen, Luis Henrique Flores; Borges, William de Castro; Andrade, Milton Hércules Guerra de; Borges, William de Castro; Sanson, Ananda Lima; Cabral, Fernanda Janku
A espécie Limnoperna fortunei (Dunker, 1857), é um molusco bivalve, conhecido popularmente como mexilhão dourado o qual representa atualmente um sério problema ambiental e econômico. Este trabalho teve como objetivo a caracterização do proteoma solúvel de L. fortunei por meio de cromatografia de afinidade com imobilizante niclosamida para a prospecção de possíveis alvos ligantes desse moluscicida. Para este fim, a niclosamida foi reconstruída no adsorvente em resina de Sepharose 4B. O extrato total do mexilhão dourado, L. fortunei, foi aplicado à coluna de afinidade e após lavagens sucessivas da coluna, as proteínas ligantes foram eluídas com niclosamida/DMSO. Em seguida, procedeu-se com a identificação em larga escala das proteínas eluídas por meio de cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas (LC-MS/MS). A interrogação dos dados espectrais, contra o proteoma predito de L. fortunei, permitiu a identificação de 221 grupos de proteínas. A anotação das proteínas identificadas foi realizada por meio de busca de similaridade, utilizando o algoritmo BLASTp. Dentre as proteínas identificadas destacam-se aquelas pertencentes ao citoesqueleto, como actina beta 1, tubulinas (isoformas alfa e beta), além de proteínas relacionadas ao estresse e imunidade tais como proteínas de choque térmico, sendo elas: HSP90, HSP70 e HSP20 e calreticulin. Os resultados obtidos permitiram agregar conhecimento molecular ao mecanismo de ação da niclosamida bem como apontar novas possibilidades para intervenção no controle da proliferação deste molusco invasor.
Análises de QTL e genômica comparativa para estudar mecanismos regulatórios da H+-ATPase de membrana.
(2021) Barbosa, Patrícia Gonçalves Prates; Brandão, Rogélio Lopes; Cunha, Aureliano Claret da; Cruz, Izinara Rosse da; Brandão, Rogélio Lopes; Fietto, Luciano Gomes; Mendes, Tiago Antônio de Oliveira; Andrade, Milton Hércules Guerra de; Silva, Silvana de Queiroz
A H+ -ATPase é uma proteína presente na membrana citoplasmática de plantas e fungos e desempenha um papel essencial na geração de um gradiente eletroquímico de prótons, importante para a captação de nutrientes e regulação do pH intracelular. A ativação da H + -ATPase da membrana citoplasmática em Saccharomyces cerevisiae induzida por glicose é supostamente atribuída a um sinal de cálcio intracelular correlacionado ao metabolismo do fosfatidilinositol. Em estudos anteriores do nosso grupo de pesquisa, foi observada diferença de fenótipo entre as cepas S. cerevisiae BY4742 arg82Δ e PJ69 arg82Δ através do teste de atividade da H + -ATPase, indicando que o fenótipo de maior ativação da H + -ATPase está relacionado a vários genes. Diante do exposto, o objetivo deste trabalho foi utilizar diferentes abordagens genômicas para identificar novos componentes da regulação induzida por glicose da H + -ATPase. Para isso, foram realizados o sequenciamento do genoma segregante agrupado, mapeamento de QTLs e análises de Bioinformática para identificar o possível motivo da diferença de fenótipo e, ou, novos componentes desta via de transdução de sinal. Uma vez identificadas as variantes na análise de mapeamento de QTL foi desenvolvido o script SNPsInQTLselection.py para identificar as bases genéticas que podem estar envolvidas com o fenótipo de maior atividade da H+ -ATPase. Após a utilização desse script foram identificadas 42 variantes em 33 genes potencialmente envolvidos com o fenótipo de interesse. Para priorização desses genes candidatos foi realizado análise de enriquecimento e interatoma que permitiram identificar 10 genes enriquecidos e envolvidos na via da telomerase e do fosfatidilinositol (STT4, PIK2, UGA2, EST1, MEC3, HEK2, TOP3, PSO2, STO1, FUR4). Cepas do background BY contendo essesrespectivos genes deletados (coleção EUROSCARF) foram utilizadas para teste de fenótipo de acidificação extracelular e sinalização de cálcio induzida por glicose. Por meio desses testes, 4 (UGA2, FUR4, EST1 e STT4) dos 10 genes enriquecidos, apresentaram o fenótipo de maior ativação da H+ -ATPase, fenótipo esse evidenciado nos testes de acidificação extracelular e sinal de cálcio. Destes 4 genes, vale destacar o STT4 visto que, de acordo com a função descrita para esse gene na literatura o fosfatidilinositol-4-fosfato pode exercer um papel na regulação da via de ativação de H + -ATPase, controlando a atividade da fosfolipase C. Tendo em vista uma relação positiva entre atividade da H + - ATPase e desempenho fermentativo, estudos futuros podem ser feitos com os genes/alelos identificados neste trabalho, com aplicação em cepas de leveduras industriais 8 visando a melhoria na eficiência de processos fermentativos. Os genes (UGA2, FUR4, EST1 e STT4) merecem investigação detalhada para verificação do possível envolvimento na via de sinalização da H+ -ATPase. Esse trabalho apresenta pela primeira vez uma estratégia de Bioinformática para identificar genes candidatos quando o resultado do mapeamento de QTL não for significativo.
Análises genômicas para otimização da produção de compostos aromatizantes por estirpe de Saccharomyces cerevisiae isolada de produção de cachaça.
(2018) Araújo, Thalita Macedo; Brandão, Rogélio Lopes; Diniz, Raphael Hermano Santos; Mendes, Tiago Antônio de Oliveira; Borges, William de Castro; Fietto, Luciano Gomes; Brandão, Rogélio Lopes; Andrade, Milton Hércules Guerra de
A qualidade das bebidas alcoólicas está intimamente relacionada à presença de concentrações equilibradas de compostos voláteis, subprodutos do processo de fermentação alcoólica e altamente influenciados pela linhagem da levedura utilizada de tal modo que a compreensão das bases moleculares da produção de compostos desejáveis represente a possibilidade do incremento da qualidade de bebidas fermentadas visando a agregação de valor ao produto final. O presente trabalho tem como objetivo realizar uma análise de características genéticas e fisiológicas das leveduras isoladas da produção de cachaça com potencial para aplicação na produção de outras bebidas alcoólicas. Desse modo, 118 linhagens da coleção LBCM foram avaliadas quanto a capacidade de metabolização de maltose, produção de baixas concentrações de sulfeto de hidrogênio, capacidade de transporte de maltotriose e capacidade de produção de compostos voláteis. A despeito de sua origem comum, as leveduras avaliadas apresentaram diferenças significativas em sua fisiologia. Algumas dessas leveduras apresentam potencial biológico para aplicação na produção de outras bebidas, como, por exemplo, cerveja. A linhagem LBCM1073 foi selecionada dentre as demais por ser heterotálica e pela sua capacidade de produção de acetato de isoamila, um éster altamente desejável em diversas bebidas alcoólicas. Após sequenciamento genômico dessa levedura, com cobertura de 263 vezes e a predição de 5686 genes, análises de genômica comparativa revelaram que a linhagem LBCM1073 apresenta um conjunto de 24 genes ausentes na linhagem laboratorial S. cerevisiae S288c. Alguns desses genes apresentam similaridade com S. bayanus e Lachancea sp. Um total de 64,15% dos genes da linhagem LBCM1073 apresenta ortólogos com genes de 40 ascomicetos avaliados. Dentre as vias já mencionadas na literatura como relacionadas à produção de compostos voláteis, a via de sinalização mTOR e a glicólise, são as que apresentaram maior percentual de genes ortólogos, justificado pela ampla distribuição dessas duas vias dentre os organismos utilizados para análise. Ao serem comparadas as sequências de aminoácidos de 34 enzimas,relacionadas à produção de compostos responsáveis por aromas, 13 foram idênticas entre LBCM1073 e S. cerevisiae S288c. Para as demais, as proteínas codificadas por LEU4, PMA1, RSP5, TOR1 e FAS2 não apresentaram as substituições descritas na literatura como relacionadas à maior produção de compostos on flavour. Em conjunto, esses dados mostram que LBCM1073 e S. cerevisiae S288c apresentam diversas distinções a nível genômico. Uma metodologia capaz de contribuir para melhor elucidar essas diferenças em relação à produção de compostos secundários à fermentação é a técnica de BSA (Bulked Segregants Analisys) ou análise de agrupamentos de segregantes. As análises fenotípicas de segregantes obtidos do cruzamento entre LBCM1073 e S. cerevisiae S288c revelou uma discreta relação direta entre a capacidade de conversão de álcool isoamílico em acetato de isoamila e o crescimento na presença de TFL 0,5 mM. Além disso, os segregantes já obtidos e avaliados poderão ser empregados na análise de QTLs envolvidos na produção de acetato de isoamila.
Antigenic peptides capable of inducing specific antibodies for detection of the major alterations found in type 2B von willebrand disease.
(2013) Paro, Marina de Oliveira; Ferreira, Cyntia Silva; Vieira, Fernanda Silva; Santana, Marcos Aurélio de; Borges, William de Castro; Lopes, Maria Sueli Silva Namen; Leclercq, Sophie Yvette; Rodrigues, Cibele Velloso; Andrade, Milton Hércules Guerra de
VonWillebrand disease (VWD) is an inherited hemorrhagic disorder promoted by either quantitative or qualitative defects of the von Willebrand factor (VWF). The disease represents the most common human coagulopathy afflicting 1.3% of the population. Qualitative defects are subdivided into four subtypes and classified according to the molecular dysfunction of the VWF. The differential diagnosis of the VWD is a difficult task, relying on a panel of tests aimed to assess the plasma levels and function of the VWF. Here, we propose biochemical approaches for the identification of structural variants of the VWF. A bioinformatic analysis was conducted to design seven peptides amongwhich threewere representatives of specific amino acid sequences belonging to normal VWF and four encompassed sequences found in the most common VWD subtype 2B. These peptides were used to immunize mice, after which, peptide-specific immunoglobulins were purified. This resulted in four Ig preparations capable of detecting alterations in the subtype 2B VWD plus additional three antibody fractions targeting the normal VWF. The panel of antibodies could serve many applications among them (1) assessment of VWF: antigen interaction, (2) VWF multimer analysis, and (3) production of monoclonal antibodies against VWF for therapeutic purposes as in thrombotic thrombocytopenic purpura.
Aspectos toxicológicos do tratamento crônico de ratos Wistar com dibenzotiofeno e dibenzotiofeno sulfona : indução de câncer e marcadores tumorais.
(Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós Graduação, Universidade Federal de Ouro Preto., 2011) Rúbio, Karina Taciana Santos; Andrade, Milton Hércules Guerra de
O alto conteúdo de compostos orgassulfurados nos derivados de petróleo compromete sua qualidade; assim, sua remoção ou conversão a substâncias menos tóxicas são importantes etapas durante o refinamento de óleo. Os limites de concentração para esses compostos estão sob rígido controle em diversos países com o objetivo de minimizar seu impacto negativo sobre a saúde animal e o ambiente. Dentre eles, o dibenzotiofeno (DBT) é um hidrocarboneto policíclico aromático que contém um átomo de enxofre em substituição a um carbono em sua estrutura. Devido à importância dessas moléculas na oncogênese e a escassez de investigações toxicológicas relacionadas ao DBT, este trabalho se propôs a realizar uma avaliação dos efeitos tóxicos promovidos por um tratamento crônico de ratos Wistar com doses sub-letais (30 e 150 mg/kg) de DBT e seu derivado oxidado DBTO2 (dibenzotiofeno sulfona), ambos administrados durante 10 semanas. Em paralelo, seus efeitos tóxicos foram comparados com aqueles provocados pelo tratamento com o agente mutagênico clássico, 1,2-dimetilhidrazina (DMH), administrado a 30 mg/kg durante o mesmo período. Na 14º semana após a última dose, os animais foram sacrificados para uma avaliação inicial da contagem de células sanguíneas e das funções hepáticas e pancreáticas. Não foram observadas alterações nos parâmetros celulares ou indicações de lesões hepáticas e pancreáticas. Entretanto, lesões préneoplásicas no intestino delgado dos animais tratados com DBT e DBTO 2 mostraram-se comparáveis em intensidade e morfologia com aquelas encontradas no cólon de animais tratados com DMH. Análises histopatológicas revelaram a ocorrência de processos neoplásicos em estágio inicial de desenvolvimento. Em concordância com esse achado, os marcadores tumorais CD44 e CEA (antígeno carcinoembrionário), comumente associados ao câncer de intestino avançado, não foram detectados por Western blotting nos extratos proteicos dos animais tratados. Com o objetivo de isolar o glicoproteoma associado ao desenvolvimento deste tipo de câncer, diversos métodos de imobilização de proteína foram testados. O protocolo mais apropriado foi o FNHSCA (N-HidroxysuccinylcaproylFractogel), assim determinado por sua alta capacidade de imobilização e manutenção da atividade enzimática da tripsina bovina. Nosso próximo passo envolveu a imobilização do ligante não-específico de carboidratos, ácido amino borônico, e das lectinas ConA, Jacalina e EspecL, utilizando o protocolo selecionado, para o enriquecimento de glicoproteínas presentes em extratos totais de proteínas. Uma análise preliminar utilizando clara de ovo Silva, K.T.S. Como amostra, revelou padrões eletroforéticos distintos associados às diferentes colunas de afinidade produzidas. Enfim, uma análise comparativa das frações de proteína de animais controles e testes utilizando SDS-PAGE revelou uma discreta diferença no padrão de bandas eletroforéticas associadas aos tratamentos com DBT e DBTO 2 , e diferenças mais pronunciadas para o tratamento de animais com DMH. A identificação de tais proteínas por espectrometria de massas possui potencial para a identificação de novos marcadores moleculares para a detecção e prognóstico de alterações celulares e teciduais promovidas por esses agentes.
Atividade anti-angiogênica de inibidores de tripsina em membrana corioalantóica de Gallus domesticus.
(Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós Graduação, Universidade Federal de Ouro Preto., 2013) Ferreira, Cyntia Silva; Andrade, Milton Hércules Guerra de
Os inibidores do tipo Bowman-Birk (BBI) são proteínas contendo dois domínios inibitórios distintos para enzimas tripsina- e quimotripsina-símile. Muitos trabalhos mostram o uso desses inibidores como agentes anti-cancerígenos, no entanto, estudos prévios do nosso laboratório revelaram uma biodistribuição limitada do BBI. Peptídeos sintéticos análogos aos domínios inibitórios do BBI também apresentaram baixa biodisponibilidade, possivelmente devido à degradação. Com o objetivo de construir inibidores mais estáveis foram adicionados motivos do tipo dedo de zinco – sequências de aminoácidos com reconhecida função estabilizadora. Esses inibidores (CPI- e HPI-trip, para tripsina e CPI- e HPI-quimo, para quimotripsina) foram comparados ao inibidor nativo e às suas respectivas alças de inibição YCT-trip e YCA-quimo. A estabilidade dessas espécies químicas foi testada do ponto de vista térmico, redutor e de resistência à hidrólise. Os peptídeos sintéticos contendo dedo de zinco mostraram comportamento similar aos inibidores convencionais. A atividade biológica dos inibidores foi avaliada no complexo proteolítico proteassoma 20S de Ratos Wistar e em membrana corioalantóica de Gallus gallus domesticus. Os inibidores de quimotripsina apresentaram atividade inibitória sobre o proteassoma 20S, mas não geraram alterações na membrana corioalantóica. Da mesma forma, os análogos contendo o motivo dedo de zinco apresentaram baixa atividade tanto no proteassoma quanto na membrana. Por outro lado, os inibidores de tripsina apresentaram atividade inibitória sobre o proteassoma e produziram respostas anti-angiogênicas na concentração de 100 nM, de maneira relacionada à atividade da pentamidina, – uma droga com elevada atividade anti-tripsina. Ao contrário da pentamidina, o inibidor Bowman-Birk é considerado isento de toxicidade em humanos, colocando essa classe de inibidores como potenciais drogas anti-angiogênicas.
Atividade antiangiogênica de inibidores de tripsina.
(2015) Vieira, André Francisco de Castro; Andrade, Milton Hércules Guerra de; Andrade, Milton Hércules Guerra de; Castro, Ieso de Miranda; Cardoso, Leonardo Máximo
Os inibidores Bowman-Birk, comumente chamados de BBI, são moléculas proteicas caracterizadas pela presença de dois domínios independentes, capazes de inibir serino-proteases. Embora os mecanismos de atividade biológica dessas moléculas não estejam totalmente elucidados, o interesse por essa classe de inibidores está relacionado com a descoberta de que o BBI pode atuar como agente preventivo do câncer. A capacidade do BBI de prevenir a carcinogênese tem sido estudada extensivamente, tanto em sua forma purificada quanto na forma de extrato proteico de soja enriquecido de BBI, chamado de BBI concentrado (BBIC). Parte do efeito antitumoral pode estar relacionada a uma possível atividade anti-angiogênica, uma vez que proteases que degradam a matriz extracelular podem ter atividade reduzida na presença de inibidores de tripsina. Esse trabalho teve como proposta a avaliação da atividade anti-angiogênica de inibidores de tripsina e domínios sintéticos relacionados ao BBI. Nesse sentido foram avaliados os peptídeos inibidores de tripsina e quimotripsina, sintetizados pelo nosso grupo de pesquisa utilizando-se o protocolo de síntese em fase sólida estabelecido por Merrifield (1963), o BBI purificado através de cromatografia de troca iônica, o inibidor de semente de abóbora CMTI purificado pelo método de cromatografia de afinidade e pentamidina. O inibidor BBI quando purificado em cromatografia de troca iônica demonstrou alta capacidade anti-angiogênica nas doses de 7000 até 70 pmols, enquanto quando purificado em cromatografia de afinidade ocorre à perda de praticamente toda sua atividade antitripsina e antiangiogênica, demonstrando a importância da integridade desse domínio na atividade. Os peptídeos sintéticos também foram ativos entre as doses de 7000 a 700 pmols, sendo a maior atividade observada para o peptídeo inibidor de tripsina. O inibidor de abórora purificado em cromatografia de afinidade também apresentou resposta anti-angiogênica nas concentrações de 7000 a 700 pmols em intensidade semelhante ao inibidor de tripsina sintético. A atividade ani-angiogênica associada à inibição de tripsina promovida pelos inibidores naturais e análogos gerou uma resposta máxima de 40% de redução da angiogênese. Entretanto, a pentamidina apresentou-se ativa entre doses de 7000 a 7 pmols com uma redução de até 80% na angiogênese, possivelmente, pelo fato de apresentar uma atividade antiproliferativa além da inibição de proteases. Esses resultados reforçam as evidências que inibidores de tripsina são dotados de atividade anti-angiogênica e que inibidores proteicos com propriedades antitumorais, como o BBI, podem exercer em parte, sua ação mediante a inibição da angiogênese.
Atividade cicatrizante de peptídeos sintéticos ricos em prolina e argina em modelo de escisão cutânea do dorso de Mus musculus swiss.
(2018) Fernandes, Arádia Gonzales de Oliveira; Andrade, Milton Hércules Guerra de; Babá, Élio Hideo; Cardoso, Leonardo Máximo; Andrade, Milton Hércules Guerra de
A pele é o maior órgão do corpo humano e possui funções cruciais na manutenção da homeostase assim como na saúde geral. As feridas são o resultado de lesões na pele e podem ser causadas por queimaduras, insetos, agentes microbianos, diabetes, isquemia e trauma. A cura de feridas é um processo essencial para reestabelecer a barreira protetora que defende o corpo do ambiente. Tipicamente, a cicatrização aguda de feridas é um processo bem organizado que leva a um reparo tecidual previsível, com plaquetas, queratinócitos, células imunológicas, células microvasculares e fibroblastos desempenhando papéis importantes na restauração da integridade tecidual. A cicatrização é um processo evolutivo conservado entre as espécies e abrange processos distintos, entretanto sobrepostos espacialmente e temporalmente que incluem a hemostasia/coagulação, inflamação, proliferação celular/reepitelização e a remodelação da matriz extracelular. Proteínas possuem um papel fundamental em todos os processos biológicos, sendo o equilíbrio finamente regulado entre a síntese e degradação fator decisivo na homeostase celular. O peptídeo natural da família das cateciclinas PR-39 (RRRPRPPYLPRPRPPPFFPPRLPPRIPPGFPPRFPPRFP) é um peptídeo natural rico em prolina e arginina secretado por macrófagos que teve sua capacidade de inibir a atividade catalítica do proteassoma 20S demonstrada assim como capacidade anti-inflamatória, através da inibição da degradação de fatores IκB, e angiogênica pela inibição da degradação de HIF-1α. Em estudos anteriores, foi demonstrado uma atividade inibitória sobre o proteassoma assim como uma atividade angiogênica de análogos ao PR-39. A análise do resultados da área da ferida, demonstra aumento da velocidade cicatrizante para o PR-11 e F-12 no décimo dia na concentração de 10-5 M, e no sétimo e décimo dia nas concentrações de 10-4 M e 10-3 M. O Bephantol® a 10-4 M, um cicatrizante clássico com dexpantenol (pré-vitamina B5), foi utilizado como controle positivo. Este apresenta aumento da velocidade de fechamento da ferida apenas no décimo dia de tratamento. Os análogos PR-11 e F12 apresentaram uma presença inferior de exudado indicativo de infecção na concentração avaliada de 10-4 M a partir do sétimo dia e o controle positivo com Bephantol® 10-4 M apresentou essa atividade apenas no décimo dia de tratamento. Esses resultados indicam a atividade antimicrobiana apresentada pelos análogos. Assim, a capacidade de aumento na velocidade de cicatrização da ferida assim como a diminuição da infecção das mesmas, torna os análogos PR-11 e F-12 ótimos candidatos a criação de formulação para utilização como cicatrizante.
Atividade moluscicida e interações moleculares da nitazoxanida com Limnoperna fortunei.
(2018) Freitas, Lorran Miranda Andrade de; Andrade, Milton Hércules Guerra de; Souza, Gustavo Henrique Bianco de; Cardoso, Leonardo Máximo; Isoldi, Mauro César; Vieira Filho, Sidney Augusto; Andrade, Milton Hércules Guerra de
O Limnoperna fortunei é responsável por impactos econômicos, principalmente no setor hidrelétrico responsável pela maior parte da produção de energia elétrica no Brasil. Atualmente o cloro é o agente mais empregado no combate às infestações pelo L. fortunei, entretanto, sua utilização é limitada pelas agências ambientais devido ao potencial tóxico. A substância 2-acetolyloxy-N-(5-nitro-2-thiazolyl)-benzamide (NTZ) induziu mortalidade de 80 a 60% em concentrações de 5 a 1 ppm respectivamente. Nessas concentrações, a droga possui baixa toxicidade em organismos superiores aeróbicos. Estudos em peixes demonstraram baixo potencial toxicológico, indicando que pode ser usada com segurança na dose 1 ppm. Visando alcançar melhor desempenho da droga e utiliza-la em menores concentrações, a amônia foi associada a 1 ppm para ampliar o efeito moluscicida do NTZ. Nossos resultados mostram uma potencialização do efeito e uma mortalidade de 80% com um dose 10 vezes menor associada a 1 ppm de ammonia. A droga pode ser facilmente removida da água de descarte logo após o tratamento de tubulações, se recolhida em reservatório contendo 1% de suspensão de cravão ativado sob agitação. Essa suspensão remove pelo menos 99% de pulsos de concentrações de 5 ppm em 15 segundos de exposição. Além disso, a capacidade máxima de retenção do carvão atinge 10% do seu peso. Esse estudo traz como perspectiva imediata a criação de um sistema de fluxo contínuo de remoção do NTZ da água de rejeito e a possibilidade dispensa-la em águas fluviais sem causar danos ambientais. O NTZ foi imobilizado em Sepharose, com o objetivo de isolar e identificar as proteínas que interagem de forma específica ao NTZ. Empregando-se a espectrometria de massas foram identificadas algumas proteínas ligantes que foram analisadas como possíveis alvos de ação. A arginina quinase, considerada alvo de drogas antiparasitárias e enzima fundamental para a manutenção do organismo em anaerobiose, foi identificada na fração retida. Os resultados de ensaios enzimáticos demonstram que o NTZ inibe arginina quinase em concentrações molares de 10-4M. Devido a importância dessa enzima e a possiblidade de acúmulo da droga durante a filtração de água realizada por esses organismos consideramos a possibilidade que esse mecanismo possa explicar o efeito tóxico do NTZ sobre o L. fortunei. Além disso, a interação entre a droga e proteínas envolvidas na regulação da apoptose também poderiam contribuir para essa atividade tóxica.
Avaliação da atividade antiangiogênica do peptídeo sintético análogo a lunasina e do inibidor bowman-birk em membrana coriolantóica de gallus domesticus.
(2014) Vieira, Fernanda Silva; Andrade, Milton Hércules Guerra de
A angiogênese ou neovascularização é um processo que inclui a ativação, adesão, proliferação e transmigração de células a partir de vasos sanguíneos pré-existentes, formando novos vasos. Para que isso ocorra, as células endoteliais devem primeiramente escapar da sua localização estável, através da ruptura da membrana basal, mediada por serino proteases (SPs) e metaloproteases (MPs) e migrar em direção ao estímulo angiogênico. Neste sentido, o equilíbrio entre as proteases e seus inibidores endógenos é necessário para manter a homeostase celular e a angiogênese fisiológica. Os inibidores de proteases do tipo Bowman-Birk (BBI) são proteínas caracterizadas pela presença de dois domínios independentes, capazes de inibir proteases tripsina-símile e quimotripsina-símile. Dotado de capacidade antitumoral essa molécula pode atuar inibindo proteases envolvidas na angiogênese. A capacidade do BBI de prevenir a carcinogênese tem sido comprovada, tanto em preparações enriquecidas, o BBI concentrado (BBIC) quanto em preparações purificadas. Entretanto, essa atividade antitumoral pode estar relacionada à presença de outras substâncias em sua preparação. Mais recentemente a Lunasina tem sido apontada como o principal componente responsável por tal atividade. O mecanismo de ação proposto para a Lunasina está relacionado à capacidade de inibição da acetilação de histonas, regulando a desespiralização da cromatina e assim, inibindo a proliferação celular. O presente trabalho teve como objetivo avaliar o potencial antiangiogênico de ambas as substâncias tendo em vista a possibilidade de inibição de enzimas proteolíticas pelo BBI e a atividade antiproliferativa da Lunasina. A avaliação do potencial antiangiogênico foi realizada através do Ensaio em Membrana Corioalantóica (CAM) de Gallus domesticus. Para identificar as atividades biológicas dessas proteínas da soja e explorar os possíveis mecanismos relacionados à atividade antiangiogenica, o domínio ativo da Lunasina (PL22) foi sintetizado e testado no ensaio de CAM in vivo. Testamos ainda o BBI purificado a partir de sementes de soja e a associação de PL22 e BBI. O peptídeo PL22 e o BBI apresentaram atividade na redução de vasos sanguíneos, a partir da dose de 7000 pmol. A porcentagem de redução do número de bifurcações em relação ao controle foi de 18% para o BBI na dose de 70 pmol e de 31% para o peptídeo PL22 na mesma dose. Entretanto não foi verificado efeito cooperativo ou sinérgico na associação do peptídeo PL22 com o BBI. Não foram observadas variações na expressão dos marcadores conexina-43 e VEGF pela técnica de Western blotting, sugerindo esses marcadores não estão relacionados ao mecanismo de ação do BBI e PL22. Os resultados da análise corroboram as avaliações feitas pela contagem direta dos vasos em microscópio digital do ponto de vista do efeito antiangiogênico. Além disso, foi observada uma atividade antinflamatória pra ambas as subtâncias. A apreciação dos perfis eletroforéticos bidimensionais de extratos das membranas corioalantóicas tratadas com BBI e PL22 demonstram uma expressão de proteínas diferencial em relação ao controle que permitirá a identificação de possíveis marcadores visando esclarecer o mecanismo e confirmar molecularmente os efeitos constatados.
Avaliação da atividade da H+-ATPase de membrana citoplasmática em cepas de Saccharomyces cerevisiae de dois backgrounds genéticos com mutações dos genes SNF3, PMC1 e/ou ARG82.
(2017) Bessa, Maria Ana Santana e Figueiredo; Brandão, Rogélio Lopes; Santos, Fernanda Godoy; Brandão, Rogélio Lopes; Andrade, Milton Hércules Guerra de; Fietto, Luciano Gomes
A H+-ATPase de membrana plasmática, codificada pelo gene PMA1, é responsável pela formação de um gradiente eletroquímico de prótons que possibilita o controle do pH intracelular e a captação de nutrientes pela célula. A Pma1p é ativada na presença de glicose e várias proteínas estão envolvidas nesse processo, modulando de forma direta ou indireta, a atividade desta enzima. Estudos prévios, realizados em diferentes background de S. cerevisiae, correlacionaram vários genes envolvidos na atividade da Pma1p, mas ainda não foi elucidado o papel de cada um deles nesta via de ativação, bem como a relação deles em cada background estudado. No presente trabalho foi realizada a construção de múltiplos mutantes para os genes PMC1, SNF3 e ARG82 em dois diferentes background de S. cerevisiae (BY4741 e PJ69) a fim de ampliar o conhecimento dos mecanismos envolvidos na via de sinalização da ativação da H+-ATPase mediada por glicose. Para isso, foram realizados procedimentos de acidificação celular do meio, determinação da disponibilidade de cálcio intracelular e avaliação da sensibilidade ao antibiótico higromicina B e ao alumínio. Os resultados do presente trabalho confirmaram a importância dos genes ARG82, PMC1 e SNF3 na regulação da atividade da H+-ATPase de membrana citoplasmática, em S. cerevisiae. Foram verificadas variações na disponibilidade de cálcio citosólico e na atividade de Pma1p entre os mutantes construídos. Aparentemente, a proteína Arg82p, dentre as três proteínas estudadas neste trabalho, possui um papel mais importante na ativação da enzima Pma1p, seja na: (i) modulação do cálcio intracelular, (ii) na acidificação do meio, (iii) na sensibilidade à higromicina e ao alumínio, e (iv) na capacidade fermentativa das células. Contudo, apesar da importância do cálcio como regulador intracelular na atividade de Pma1p, não foi verificada uma relação direta entre a concentração de cálcio citosólico e a atividade de Pma1p sugerindo que outros fatores possam estar envolvidos. Ademais, os diferentes resultados encontrados, nos diferentes backgrounds, demonstraram que o efeito das mutações poderia ser dependente da linhagem analisada.
Avaliação da expressão gênica de tecidos intestinais neoplásicos de ratos tratados com dibenzotiofeno e naftaleno.
(2016) Miranda, Denise Coutinho de; Andrade, Milton Hércules Guerra de; Rodrigues, Cibele Velloso; Andrade, Milton Hércules Guerra de; Isoldi, Mauro César; Oliveira, Laser Antônio Machado de
O objetivo do presente estudo foi investigar a expressão gênica em intestino delgado de ratos Wistar submetidos aos regimes crônicos de administração de dibenzotiofeno e compará-los ao naftaleno. Ratos Wistar foram divididos em seis grupos experimentais: CON-12 – Controle, 12 semanas; CON-18 – Controle, 18 semanas; DBT-12 – Dibenzotiofeno, 12 semanas; DBT-18 – Dibenzotiofeno, 18 semanas; NAF-12 – Naftaleno, 12 semanas; NAF-18 – Naftaleno, 18 semanas. Os animais dos grupos NAF-12 e DBT-12 foram tratados durante 12 semanas com 0,7 mmols/Kg, dos respectivos compostos carcinógenos. Os grupos NAF-18 e DBT-18 foram tratados durante 18 semanas e submetidos a 8 semanas de latência, com 0,7 mmols/Kg, dos respectivos compostos. Os ratos do grupo controle foram submetidos aos mesmos procedimentos, porém sem a aplicação dos carcinógenos. Foram avaliadas a expressão gênica de 87 genes envolvidos com o processo da carcinogênese. Com o objetivo de quantificar os níveis de mRNA dos genes selecionados, foi realizada técnica de qPCR, seguido da análise pelo método de quantificação relativa da expressão gênica (ΔCq). Os genes alvos foram normalizados pelo gene 18S, 2-ΔCq e escore Z. Para a análise de enriquecimento dos genes foi utilizada ferramenta de bioinformática “The Rat Genome Database 2015”. Os resultados obtidos demonstram 81 regulações positivas e 4 negativas para o NAF-12; 83 regulações positivas e 4 negativas para o DBT-12; 69 regulações positivas e 6 negativas para NAF-18; 36 regulações positivas e 43 negativas para DBT-18. Identificou-se um perfil de expressão gênica que é característico para o DBT e naftaleno consistentes com a indução de neoplasia e câncer. O perfil da regulação dos genes envolvidos na progressão tumoral após a interrupção do estímulo permite concluir, que em ratos, as exposições ao naftaleno mantem por mais tempo, em maior parte dos marcadores, uma resposta mais intensa no sentido da evolução do câncer quando comparado ao DBT. Por outro lado, alguns genes muito importantes na avaliação do câncer apresentaram uma regulação exclusiva para o tratamento com DBT em relação ao naftaleno e consistente com a manutenção dessa patologia após a latência.
Avaliação do potencial carcinogênico do dibenzotiofeno e dibenzotiofeno sulfona em ratos Wistar.
(Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós Graduação, Universidade Federal de Ouro Preto., 2012) Pinto, Igor Antônio de Araujo; Andrade, Milton Hércules Guerra de
O elevado nível de compostos sulfurados em derivados do petróleo é considerado prejudicial à qualidade de combustíveis, sendo sua remoção, mesmo que parcial uma das exigências no processo de refino. Além disso, legislações específicas delimitam sua concentração máxima em combustíveis fósseis, a fim de minimizar efeitos negativos dos compostos organossulfurados no ambiente. Dentre tais compostos, o dibenzotiofeno (DBT) é um hidrocarboneto policíclico aromático sulfurado, referência em trabalhos de remediação ambiental e com atividade carcinogênica. Considerando a importância dessa classe de substâncias na oncogênese e a escassez de estudos toxicológicos relacionados ao DBT, essa dissertação apresenta como objetivo, uma avaliação dos efeitos tóxicos provocados pelo tratamento crônico de ratos Wistar com doses sub-letais de DBT e de seu derivado oxidado DBTO2 (dibenzotiofeno sulfona), e compara o potencial toxicológico dessas substâncias com o agente mutagênico clássico 1,2-dimetilhidrazina (DMH). Esse trabalho permitiu uma avaliação do tratamento crônico com a dose de 30 mg/Kg de DBT e DBTO2 em ratos Wistar, sendo observadas lesões pré-neoplásicas nos intestinos delgado e grosso dos animais tratados, com intensidade e características semelhantes às lesões observadas no cólon de ratos tratados com DMH. As lesões, identificadas pelas análises histopatológicas, indicaram a ocorrência de um processo neoplásico em fase inicial de desenvolvimento. Além disso, verificou-se a marcação de células empregando-se técnicas imunohistoquímicas com anticorpos para o antígeno carcinoembrionário (CEA) e CD44, para os grupos DMH, DBT e DBTO2, com intensidades semelhantes. Através dessa avaliação, tais resultados indicam que a capacidade de induzir neoplasias do DBT e do DBTO2, se assemelha ao DMH, que é considerado um potente carcinógeno. Além disso, foi realizada análise da expressão gênica, por meio de qPCR, de transcritos de Cd44, c-Myc, c-Jun, Stat3, Psma6, Mapk3 e Sulf1, que são genes conhecidos como bons indicadores de câncer em fase avançada. Esses resultados apontaram que não ocorreram alterações nos níveis de expressão desses genes suficientes para a detecção em extratos de pólipos intestinais. Paralelamente, investigando-se a possibilidade de utilizar o inibidor Bowman-Birk como ligante específico de proteases usualmente superexpressas em tumores, cortes frescos de pólipos intestinais foram incubados com um conjugado BBI-FITC. Verificou-se uma marcação do conjugado BBI-FITC mais intensa em todos os grupos submetidos aos tratamentos com os agentes químicos. O aumento da fluorescência nos grupos testes foi em torno de 1,7 vezes maior em relação aos controles, e de maneira semelhante entre os grupos DMH, DBT e DBTO2. Sendo assim, verificou-se que o conjugado BBI-FITC, proposto como um ligante específico de proteases tripsina e quimotripsina símiles, indicou ser satisfatório para detecção do aumento da concentração de proteases-alvo do BBI, em animais tratados com agentes carcinógenos em estágio neoplásico inicial de desenvolvimento. Esses resultados demonstram que os inibidores de Bowman-Birk podem ser úteis no diagnóstico precoce de análises histopatológicas de animais submetidos à exposição a agentes químicos como DMH e também para os hidrocarbonetos policíclicos aromáticos sulfurados como o DBT e DBTO2.
Avaliação proteômica e caracterização do potencial angiogênico do peptídeo PR-11 e análogos.
(2016) Breguez, Gustavo Silveira; Andrade, Milton Hércules Guerra de; Borges, William de Castro; Andrade, Milton Hércules Guerra de; Castro, Ieso de Miranda; Cardoso, Leonardo Máximo; Borges, Marcia Helena; Silva, Nilson Penha
O proteassoma tem sido considerado um potencial alvo farmacológico devido ao seu envolvimento em processos vitais relacionados à proteólise celular, sendo a mais importante entre as vias de degradação. A literatura demonstra que estruturas análogas ao peptídeo PR-11 (RRRPRPPYLPR), que corresponde aos 11 primeiros aminoácidos da porção N-terminal do peptídeo natural PR-39, apresentam uma forte inibição sobre o proteassoma 20S. Inicialmente descoberto por suas propriedades antimicrobianas, os peptídeos desta classe desempenham importantes efeitos anti-inflamatórios e angiogênicos. Apesar da ampla atividade biológica, os estudos moleculares são predominantemente limitados à inibição do proteassoma por estes peptídeos. Dessa forma, este trabalho teve como principais objetivos: avaliar o proteoma de culturas de fibroblastos expostas ao PR-11; identificar possíveis alvos desse peptídeo por sua imobilização em coluna de afinidade e caracterizar o perfil angiogênico do PR-11 e moléculas análogas por meio de implantes subcutâneos de esponjas em camundongos. Os peptídeos PR-11, F12 e C8C15 foram sintetizados empregando-se a estratégia Fmoc em fase sólida, purificados em sistema HPLC e identificados por espectrometria de massas. A estratégia shotgun label-free foi utilizada para avaliar as alterações proteômicas causadas pela exposição de culturas de fibroblastos ao PR-11 a 1 μM durante 2, 6 e 10 horas. Esta abordagem revelou que mais da metade das proteínas diferencialmente expressas identificadas estão relacionadas à sinalização celular, transcrição e tradução. Proteínas diretamente associadas à angiogênese pela regulação ou interação com o HIF-1α foram significativamente alteradas. Além disso, ao menos três proteínas diferencialmente expressas da via do NF-κB relacionam-se a uma resposta anti-inflamatória. Em paralelo, a interação do PR-11 imobilizado com extrato solúvel de fígado de ratos permitiu a identificação de novos ligantes ao peptídeo, destacando-se a gC1qR. Esta proteína está envolvida na internalização celular do peptídeo CGKRK, o qual assemelha-se ao segmento N-terminal do PR-11. Nossos resultados apresentam evidências preliminares de que a proteína gC1qR possa mediar a internalização celular do PR-11. De modo geral, a avaliação histológica das esponjas dos animais tratados com os peptídeos PR-11, F12 e C8C15 demonstra um aumento do perfil proliferativo e maturação do processo angiogênico. Por fim, os dados obtidos neste trabalho apresentam importantes informações para a elucidação dos mecanismos moleculares envolvidos nas atividades biológicas promovidas pelo PR-11 e moléculas similares.
Bowman-Birk inhibitors, proteasome peptidase activities and colorectal pre neoplasias induced by 1,2-dimethylhydrazine in Swiss mice.
(2012) Carli, Alessandra de Paula; Vieira, Paula Melo de Abreu; Rúbio, Karina Taciana Santos; Cota, Renata Guerra de Sá; Carneiro, Cláudia Martins; Borges, William de Castro; Andrade, Milton Hércules Guerra de
Bowman-Birk inhibitors (BBIs) are protein molecules containing two inhibitory domains for enzymes similar to trypsin and chymotrypsin. Interest in these inhibitors arose from their properties against the cancer chemically induced by 1,2-dimethylhydrazine (DMH). In this study the effect of two BBI preparations (from Glycine max and Macrotyloma axillare) were evaluated for the prevention of colorectal neoplasia induced by intraperitoneal injections of DMH, given at a dose of 30 mg/kg, during 12 weeks. Mice treated with DMH presented histopathological alterations consistent with tumor development, augmented CD44 expression and increased proteasome peptidase activities. Lysosomal fractions, obtained from the intestines, were chromatographed in a Sepharose-BBI column and increased activity for trypsin and chymotrypsin-like proteases recovered from DMH-treated animals. In parallel, mice treated for eight weeks with BBIs showed a decrease in the chymotrypsin and trypsin-like proteasome activities compared to animals fed on normal diet. For the groups receiving simultaneous treatment with DMH and BBIs, dysplasic lesions were not observed and proteasome peptidase activities were similar to the control group after the 24th week. These results suggest that the mechanism by which BBIs could prevent the appearance of pre neoplastic lesions is associated with inhibition of both the lysosomal and proteasome- dependent proteolytic pathways.
Correlação da atividade do proteassoma, expressão de CD44 e enzimas proteolíticas em extratos intestinais de camundongos tratados com 1,2 dimetilhidrazina e inibidores Bowman-Birk.
(Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós Graduação, Universidade Federal de Ouro Preto., 2011) Carli, Alessandra de Paula; Andrade, Milton Hércules Guerra de
Os inibidores do tipo Bowman-Birk (BBI) são moléculas protéicas contendo dois domínios inibitórios distintos para enzimas semelhantes à tripsina e quimotripsina. O interesse por essa classe de inibidores decorre de estudos que demonstraram o efeito protetor dos BBI no câncer induzido quimicamente. No presente trabalho avaliou-se o efeito dos BBI isolados de Macrotyloma axillare e Glycine max na prevenção de neoplasias colo-retal induzidas por injeções intraperitoneais de dimetilhidrazina (DMH) durante 12 semanas. Os grupos de camundongos controle e testes (tratados com DMH) receberam uma dieta contendo BBI, na dose de 0,1% (p/p) associada (DMHV) ou não às vitaminas A, C e E, durante 24 semanas. Camundongos tratados com DMH apresentaram alterações histopatológicas compatíveis com a formação de pólipos neoplásicos. Em concordância com a histologia, a análise do marcador tumoral CD44, por Western blotting, revelou aumento significativo de expressão nos animais tratados com DMH e DMHV. Os extratos protéicos provenientes desses tecidos apresentaram aumento significativo de atividade proteolítica dependente de proteassoma, em ensaios peptidásicos para as atividades tripsina e quimotripsina símiles. Por outro lado, para o grupo de animais tratados com DMH e BBI observou-se atividade proteassomal comparável àquela dos animais do grupo controle. O tratamento de animais com BBI isoladamente promoveu a redução da atividade proteolítica dependente de proteassoma quando comparada àquela de animais alimentados com dieta normal. Além disso, retenção de enzimas com atividades proteolíticas tripsina e quimotripsina-símile, provenientes das frações lisossomal e solúvel, foi observada utilizando uma coluna de afinidade sepharose-BBI. As atividades dessas enzimas também se mostraram significativamente aumentadas no grupo de animais tratados com DMH. Esses resultados demonstraram que inibições de atividades proteolíticas distintas podem contribuir para o mecanismo protetor dos BBI. Coletivamente os resultados permitiram concluir que o tratamento com BBI foi capaz de prevenir a formação de pólipos intestinais, impedir o estabelecimento de eventos inflamatórios no intestino delgado, cólon e glândula anal, e manter em níveis normais o marcador clássico tumoral CD44.
Cromatografia de afinidade pelo ácido ε-aminocapróico para purificação e depleção de anticorpos em condições otimizadas para preservação estrutural e funcional.
(2014) Neves, Leandro Xavier; Borges, William de Castro; Andrade, Milton Hércules Guerra de; Borges, William de Castro; Fonseca, Cristina Toscano; Castro, Ieso de Miranda
Imunoglobulinas ou anticorpos são glicoproteínas produzidas pelas células B. Estas moléculas podem ser encontradas ancoradas na membrana plasmática da célula produtora ou em fluidos corporais, como sangue e líquido ascítico, na sua forma secretada. Sua estrutura tridimensional revela uma organização básica correspondente à associação das cadeias polipeptídicas leve e pesada. A capacidade de reconhecimento molecular altamente específico faz dessas moléculas poderosas ferramentas nas ciências biomédicas, sendo úteis nas pesquisas científicas, métodos de diagnóstico e imunoterapias. Anticorpos são obtidos a partir de soro de animais ou culturas celulares após rigorosas etapas de purificação, que se destinam à remoção de contaminantes comuns como vírus, pirogênios e proteínas abundantes. Particularmente, o isolamento de anticorpos utilizando cromatografia de afinidade permite sua purificação e depleção em amostras de plasma, precedendo as análises proteômicas. Embora vários procedimentos para purificação/depleção de anticorpos estejam atualmente disponíveis, algumas limitações como especificidade restrita à determinadas classes e espécies e alto custo, justificam o desenvolvimento de métodos alternativos. O objetivo deste trabalho foi a síntese de matrizes cromatográficas, utilizando ácido ε-aminocapróico (AEAC), para purificação e depleção de anticorpos. Quatro, das cinco, matrizes obtidas exibiram especificidade por anticorpos plasmáticos humanos e IgY da gema do ovo de Gallus gallus. O emprego de condições cromatográficas brandas, especialmente eluição em pH fisiológico e baixa força iônica, permitiu a recuperação de anticorpos funcionais, como revelado por Western blotting. O perfil eletroforético bidimensional, seguido da análise por espectrometria de massas, revelou uma heterogeneidade de isoformas e a purificação dos isotipos humanos IgG1,2,3,4, IgA1, IgD, IgM e IgY de Gallus gallus, com alto grau de pureza. Além disso, a imobilização do ácido ε-aminocapróico em micropartículas magnéticas constitui uma estratégia bem sucedida de depleção plasmática de anticorpos, a partir de pequenos volumes. Por último, a avaliação do desempenho das matrizes sintetizadas revelou a melhor capacidade de retenção da matriz pré-ativada NHS-AEAC (30 mg de anticorpo/g). Concluímos que o acoplamento do ácido ε-aminocapróico em suportes cromatográficos constitui uma alternativa para a purificação e depleção de anticorpos plasmáticos e IgY, revelando-se como uma nova ferramenta de interesse biotecnológico.
Desenvolvimento de nanoemulsão a partir do óleo essencial de folhas de Cymbopogon densiflorus (Steud.) Stapf. : avaliação da sazonalidade e atividades biológicas.
(2015) Seibert, Janaína Brandão; Santos, Orlando David Henrique dos; Souza, Gustavo Henrique Bianco de; Conceição, Edemilson Cardoso da; Andrade, Milton Hércules Guerra de
Substâncias químicas presentes especificamente em plantas podem apresentar diferentes propriedades biológicas e serem utilizadas como princípios ativos no desenvolvimento de novos produtos. Cymbopogon densiflorus é utilizada popularmente no tratamento de várias enfermidades e estudos sobre o óleo essencial desta espécie revelaram os monoterpenos como sendo seus principais constituintes. Este trabalho teve o propósito de desenvolver nanoemulsões contendo o óleo essencial de folhas de C. densiflorus, seguido do estudo da sazonalidade e avaliação de atividades biológicas. O óleo essencial foi obtido pela hidrodestilação das partes aéreas desta espécie e a sazonalidade foi analisada a cada dois meses por CG/EM. Os maiores rendimentos do óleo foram obtidos entre o período de novembro a março, havendo manutenção de mais de 90% da sua composição para todo o período analisado. As nanoemulsões foram preparadas através do método de inversão de fases, apresentando um aspecto branco leitoso e homogêneo. Amostras da formulação foram avaliadas quanto ao tamanho médio das partículas, obtendo valores em torno de 76 nm e índice de polidispersão inferior a 0,1. O valor médio do pH foi de 3,277 e um perfil de condutividade elétrica característico da inversão de fases foi observado. O potencial zeta foi próximo de -9 mV e o comportamento reológico evidenciou-se do tipo newtoniano. Além disso, a nanoemulsão demonstrou ser estável após submissão ao estresse térmico e centrifugação. A avaliação qualitativa da atividade antimicrobiana foi realizada a partir do ensaio de difusão em disco, utilizando-se cepas das bactérias Escherichia coli ATCC25922, Staphylococcus aureus ATCC25923, Pseudomonas aeruginosa ATCC27853, além da levedura Candida albicans ATCC14408. Todos os microrganismos foram sensíveis ao óleo essencial e, posteriormente, essa propriedade foi quantificada pela técnica da microdiluição seriada. A atividade antioxidante foi avaliada por meio do método de sequestro de radicais livres e os valores da CI50% da quantidade inicial de DPPH para o ácido gálico, óleo essencial e nanoemulsão foram equivalentes a 1,09x10-3; 14,689 e 73,840 mg/mL, respectivamente. E, por fim, o potencial alelopático foi determinado através de bioensaios de germinação sobre sementes de alface (Lactuca sativa), pepino (Cucumis sativus) e tomate (Lycopersicum esculentum). O óleo puro e sua forma nanoemulsionada apresentaram valores efetivos da CI50% da germinação e do crescimento da raiz para todas as sementes. Desta forma, foi possível demonstrar a viabilidade de preparar nanoemulsões contendo o óleo essencial de folhas de C. densiflorus e a capacidade destas em manter ou até mesmo aumentar o efetivo desempenho do óleo diante das propriedades antimicrobiana, antioxidante e alelopática.
Elimination of turbidity in serum iron colorimetric assay by enzymatic proteolysis.
(2003) Cardoso, Leonardo Máximo; Andrade, Milton Hércules Guerra de; Chianca Júnior, Deoclécio Alves; Silva, Marcelo Eustáquio; Pedrosa, Maria Lúcia