Nanofarmacologia na leishmaniose visceral empregando uma mistura de lipossomas convencionais e peguilados com antimoniato de meglumina e vacinas.

Abstract

Os antimoniais pentavalentes são fármacos de 1ª escolha no tratamento das leishmanioses no Brasil. Em virtude dos vários efeitos colaterais do tratamento, a associação do fármaco em lipossomas poderia aumentar a adesão e a eficácia terapêutica. Sendo assim, o objetivo deste estudo foi avaliar diferentes protocolos de tratamento aplicados à leishmaniose visceral (LV) experimental empregando uma mistura de lipossomas convencionais e peguilados com antimoniato de meglumina e a sua associação com as vacinas LBSap e LBMPL. Para avaliação da quimioterapia com as formulações lipossomais, foram utilizados camundongos BALB/c (n=12/grupo), divididos nos seguintes grupos experimentais: (i) infectados e tratados apenas com solução salina (PBS); (ii) infectados e tratados com a mistura de lipossomas convencionais e peguilados vazios (Lip V); (iii) infectados e tratados com antimoniato de meglumina na forma livre - 20 mg/kg (AM) e (iv) infectados e tratados com a mistura de lipossomas convencionais e peguilados contendo antimoniato de meglumina - 20 mg/kg (AML). Após o tratamento os animais foram submetidos à infecção experimental com 1x107 promastigotas de L. infantum, em fase estacionária de crescimento, por via endovenosa. Os camundongos receberam uma dose única do tratamento no 14o dia pós-infecção (d.p.i) e a eutanásia foi realizada no 28o d.p.i. A formulação lipossomal consistiu na mistura de lipossomas convencionais - DSPC, CHO e DCP e lipossomas peguilados - DSPC, CHO, DCP e 2000-DSPE-PEG. As caracterizações físico-químicas das formulações lipossomais demonstraram uma taxa de encapsulação do fármaco de 20,5% e 30,6% para as formulações lipossomais convencionais e peguiladas, respectivamente. A mistura das formulações lipossomais convencionais e peguiladas apresentaram um diâmetro médio de 229 nm e uma liberação estável do fármaco em 24 horas. Para avaliação da resposta compartimentalizada em relação ao tratamento com lipossomas, foi avaliada de forma quantitativa a presença de células inflamatórias no fígado. Foi observada uma diminuição significativa do processo inflamatório nos grupos tratados com antimoniais (AM e AML) e ausência de granulomas hepáticos nos animais do grupo AML. A estimulação in vitro de esplenócitos com antígeno solúvel de L. infantum (ASLi) revelou um aumento significativo de linfócitos T CD8+ produtores de IFN-γ e uma redução nos linfócitos T CD4+ e T CD8+ produtores de IL-10 apenas no grupo AML. Além disso, os animais do grupo AML apresentaram um aumento na razão IFN-γ/IL-10 para os linfócitos T CD4+ e T CD8+ específicos. Quando avaliada a eficácia do tratamento, foi observada uma positividade na detecção de DNA do parasito no baço de 41,7%, 50,0%, 25,0% e 0,0% para os grupos PBS, Lip V, AM e AML, respectivamente. Já no compartimento hepático, a positividade foi de 83,3%, 100,0%, 83,3% e 41,4% para os grupos PBS, Lip V, AM e AML respectivamente, demonstrando assim, a eficácia obtida com a formulação lipossomal peguilada do antimoniato. Uma alternativa para melhorar a eficácia da terapêutica convencional é o uso da imunoterapia atuando no reestabelecimento do sistema imune, sendo esta utilizada isoladamente ou em associação com a quimioterapia (imunoquimioterapia). Dessa forma, nós avaliamos em um protocolo de imunoquimioterapia (lipossomas + vacinas), a capacidade de indução de memória imunológica nos animais infectados. Foram utilizados camundongos BALB/c (n=12/grupo), divididos nos seguintes grupos experimentais: (i) infectados e tratados com antígeno de L. braziliensis (LB); (ii) infectados e tratados com a vacina LBMPL (LBMPL); (iii) infectados e tratados com a vacina LBSap (LBSap); (iv) infectados e tratados com a associação da vacina LBMPL e a mistura de lipossomas convencionais e peguilados contendo antimoniato de meglumina (LBMPL+AML); e (v) infectados e tratados com a associação da vacina LBSap e a mistura de lipossomas convencionais e peguilados contendo antimoniato de meglumina (LBSap+AML). A infecção foi realizada com 1x107 promastigotas de L. infantum, em fase estacionária de crescimento, por via endovenosa. O esquema terapêutico utilizando vacinoterapia foi realizado com três doses vacinais no 28º, 35º e 42º d.p.i e a formulação lipossomal foi administrada em dose única no 35º d.p.i. No 49o d.p.i foi realizada a eutanásia dos animais para análise dos fenótipos de memória central (CD62Lhi CD44hi CD27hi CD197hi) e efetora (CD62Llow CD44hi) em esplenócitos estimulados com ASLi. Foi demonstrado que a associação imunoquimioterápica da vacina LBMPL+AML induziu um maior percentual de células de memória central em linfócitos T CD4+ e T CD8+. Já a associação da vacina LBSap+AML induziu uma resposta imunológica de memória efetora na subpopulação de linfócitos T CD4+. Dessa forma, o conjunto de resultados obtidos neste trabalho permite concluir que o emprego da quimioterapia com a nanoformulação composta por uma mistura de lipossomas convencionais e peguilados contendo antimonial é promissora no tratamento da LV. Este protocolo quimioterápico foi capaz de diminuir o processo inflamatório, impedir o comprometimento da arquitetura hepática e induzir a polarização de uma resposta imune do tipo 1 (Th1), associada a redução da carga parasitária em órgãos-alvo (baço e fígado). Além disso, a avaliação imunológica da imunoquimioterapia pela associação da formulação lipossomal com a vacinoterapia, demonstrou resultados relevantes por induzir a estimulação de células de memória central (LBMPL+AML) e efetora (LBSap+AML). Portanto, as formulações lipossomais compostas pela mistura de lipossomas convencionais e peguilados contendo antimoniato de meglumina são excelentes alternativas para o tratamento da LV, tanto isoladamente quanto em combinação com a vacinoterapia.