PPBIOTEC - Programa de Pós-graduação em Biotecnologia
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Item Avaliação do potencial celulolítico e fermentativo de bactérias do gênero Clostridium e da microbiota autóctone na fermentação do bagaço de cana bruto.(2019) Menegatto, Marília Bueno da Silva; Silva, Silvana de Queiroz; Silva, Silvana de Queiroz; Gurgel, Leandro Vinícius Alves; Silveira, Wendel Batista daO bagaço de cana-de-açúcar é um subproduto agrícola considerado fonte renovável, barata e abundante em açúcares, potencialmente utilizado como matéria prima na produção sustentável de combustíveis e insumos químicos no conceito de biorrefinaria, entretanto esbarra na dificuldade de acesso aos açúcares pelos microrganismos. A utilização de bactérias produtoras de enzimas hidrolíticas aparece como alternativa na desestruturação da biomassa e fermentação dos açúcares, como as do gênero Clostridium. Sendo assim, o trabalho teve como objetivo avaliar o potencial hidrolítico e fermentativo de bactérias do gênero Clostridium, e de microrganismos autóctones na fermentação do bagaço de cana bruto. As bactérias foram isoladas a partir do enriquecimento anaeróbio do bagaço (inoculado com estrume bovino e lodo de reator anaeróbio), e caracterizadas quanto à morfologia, parede celular e produção de celulase. Os ensaios de fermentação semi-sólida do bagaço de cana bruto foram realizados com os isolados que apresentaram produção de celulase e monitorados por 192h a 37°C. Também foi monitorado o perfil fermentativo dos microrganismos autóctones através de um ensaio sem adição de inóculo. A fração líquida foi analisada para determinação da concentração dos açúcares e metabólitos e o resíduo sólido caracterizado para determinação de celulose e açúcares antes e depois dos ensaios. Dentre os isolados estudados, as culturas denominadas 10, 8 e 3 apresentaram os maiores índices enzimáticos (1,67, 1,17 e 1,11 respectivamente) e também a maior capacidade de hidrólise e remoção dos açúcares da fração celulósica e hemicelulósica no ensaio fermentativo. Os metabólitos de maior produção foram o ácido acético (~ 1,3 g/L) pela microbiota autóctone e na presença dos isolados 3 e 8; a máxima concentração de acetona (~ 500 mg/L) e do ácido butírico (~ 300 mg/L) foi observada na presença da bactéria 7, sendo esta, portanto importante na realização do metabolismo solvetogênico. Apesar dos isolados 3 e 8 terem produzido concentração similar de ácido acético detectado no ensaio não inoculado, observou-se um incremento na hidrólise da biomassa e na produção de ácido butírico nos ensaios inoculados. Sendo assim, tanto a microbiota autóctone quanto as bactérias 3 e 8 potencialmente do gênero Clostridium, são capazes de hidrolisar o bagaço de cana bruto e fermentar os açúcares lignocelulósicos a ácido acético, acetona e ácido butírico.Item Bioprospecção bacteriana para produção de bio-hidrogênio a partir de hidrolisado hemicelulósico e avaliação do processo fermentativo.(2018) Rincon, Ivon Maritza Campos; Silva, Silvana de Queiroz; Silva, Silvana de Queiroz; Oliveira Júnior, Ênio Nazaré de; Moreira, Leandro Marcio; Pantoja, Lílian de Araújo; Guimarães, Valeria MontezeA substituição das energias baseadas no petróleo por outras fontes energéticas mais ambientalmente amigáveis é uma ideia que ganha mais força a cada dia. Os resíduos da atividade agrícola e florestal são considerados matéria-prima renovável, de baixo custo e abundante, principalmente, considerando que o Brasil é um grande produtor de cana-deaçúcar. No contexto da biorrefinaria, a partir dos resíduos desta atividade agrícola podem ser produzidos vários biocombustíveis implicando no uso eficaz dos recursos e dos produtos gerados. Desse modo, este trabalho buscou isolar e selecionar linhagens bacterianas capazes de produzir bio-hidrogênio a partir da fermentação de açúcares hemicelulósicos. O processo fermentativo foi investigado utilizando substratos sintéticos e um hidrolisado lignocelulósico real. Dentre vários isolados, duas culturas se destacaram quanto à utilização dos açúcares, Enterobacter sp (isolado 2) e Raoultella sp (isolado 11). As melhores conversões na produção de bio-hidrogênio foram obtidas a partir da fermentação de 11 g/L de xilose com valores de 1,17 e 1,74 mmol H2/mmol substrato, respectivamente para Raoultella sp e Enterobacter sp, tendo o ácido acético como principal subproduto desta fermentação. Os valores das conversões diminuíram para 0,4 e 0,3 mmol H2/mmol substrato, para o isolado 2 e 11 respectivamente, quando utilizado o hidrolisado hemicelulósico real diluído. Para investigar a toxicidade do hidrolisado, inibidores foram adicionados na fermentação e para ambos os isolados, a adição de ácido acético afetou negativamente a conversão e a produção de H2. Dois métodos de destoxificação do hidrolisado lignocelulósico foram testados, os resultados mostraram que o uso de carvão ativado no ensaio de fermentação promoveu um aumento de 2x na produção de H2 (0,31mmol) para o isolado 2. Levando-se em consideração todos os resultados as linhagens Enterobacter sp 2 e e Raoultella sp 11 apresentam potencial de aplicação em processos fermentativos no contexto da biorrefinaria.Item Estudo sobre o desenvolvimento de cervejas utilizando fermentação consorciada entre bactérias do ácido láctico e levedura isolada de alambique de cachaça.(2017) Campos, Anna Clara Silva; Brandão, Rogélio Lopes; Brandão, Rogélio Lopes; Silva, Silvana de Queiroz; Pereira, Alexandre FontesA cerveja é uma das bebidas alcoólicas mais consumidas no mundo, fazendo parte da cultura da maioria das civilizações. A produção de cerveja é resultado do metabolismo das leveduras que, a partir dos açúcares presentes no mosto, formam dois produtos principais: etanol e dióxido de carbono – processo denominado fermentação. Além disso, há, geralmente, a formação de pequenas quantidades de outros componentes, chamados compostos secundários. A qualidade sensorial de bebidas fermentadas está intimamente relacionada com as concentrações equilibradas dos seus compostos secundários. Além das leveduras, bactérias lácticas também podem ser utilizadas na fermentação de bebidas, contribuindo para a qualidade sensorial do produto final. A influência dessa fermentação consorciada foi estudada na produção de uísque, vinho e cachaça, sendo seu maior benefício a produção do éster lactato de etila. Este éster, formado pela esterificação do etanol com o ácido láctico, contribui para o aroma e sabor da bebida devido ao seu caráter frutado. Os estudos já realizados com fermentação consorciada na produção de cerveja estão relacionados às cervejas Lambic, cuja fermentação acontece espontaneamente por microrganismos presentes no ambiente produtivo. Assim, o objetivo deste trabalho foi desenvolver uma cerveja a partir do inóculo controlado de Lactobacillus brevis em consórcio com a levedura Saccharomyces cerevisiae, a fim de avaliar a contribuição das bactérias lácticas sobre as características sensoriais do produto final. As quatro cepas de L. brevis (LBCM717, LBCM718, LBCM719 e LBCM720) tiveram sua capacidade de crescimento avaliado em diferentes temperaturas (15°C e 20°C), sendo que a 20°C o desempenho observado foi mais próximo à temperatura controle (30°C). As fermentações entre os quatro isolados de L. brevis em consórcio com a levedura S. cerevisiae LBCM1078 foram realizadas, primeiramente, em escala laboratorial, em meio sintético YP maltose 2%, onde foi possível avaliar o desempenho fermentativo dos microrganismos, bem como a produção de ácido láctico, ácido acético e lactato de etila. Também foi avaliado o desempenho fermentativo desses consórcios em extrato de malte 16%, comparando-se dois momentos do inóculo das bactérias lácticas: início ou final da fermentação alcoólica. As cepas LBCM718 e LBCM720, quando inoculadas no início da fermentação alcoólica, se destacaram quanto à produção de lactato de etila, sendo, portanto, selecionadas para a etapa de produção de cerveja em maior escala. Foram produzidas três cervejas utilizando consórcio entre LBCM1078 e LBCM718, consórcio entre LBCM1078 e LBCM720 e fermentação controle, somente com a levedura LBCM1078. Foram avaliados os seguintes parâmetros do produto final: álcoois superiores, ésteres de acetato, ésteres de ácido graxo de cadeia média, etanol, pH e lactato de etila. As cervejas produzidas em consórcio com bactérias apresentaram maiores concentrações de lactato de etila e isobutanol e menores concentrações de acetaldeído. Além disso, não houve prejuízo quanto ao conteúdo de etanol, pelo inóculo de bactérias. Os resultados apresentados nesse trabalho sugerem que as bactérias lácticas podem ser uma nova alternativa para a produção de cerveja com alto padrão de qualidade, uma vez que tais microrganismos são conhecidos como seguros e podem contribuir para o aroma do produto.Item Caracterização de leveduras termotolerantes para produção de etanol celulósico.(Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós Graduação, Universidade Federal de Ouro Preto., 2011) Costa, Daniela Arruda; Fietto, Luciano GomesA conversão de material lignocelulósico em açúcares fermentáveis é considerada uma alternativa promissora para aumentar a produção de etanol. Neste contexto tem sido demonstrado que maiores rendimentos em etanol são obtidos por meio do acoplamento das etapas de sacarificação e fermentação, processo chamado sacarificação e fermentação simultâneas (SSF). No entanto, um dos entraves do processo é a temperatura ótima para a realização das duas etapas; uma vez que, a ação ótima das celulases ocorre em torno de 50°C, e nquanto que a maioria dos organismos fermentativos cresce entre 30° e 37°C. Com o objetivo de viabilizar o processo SSF foi isolada e identificada uma linhagem termotolerante de Saccharomyces cerevisiae, denominada LBM-1. A fim de selecionar o microorganismo adequado e as condições ideais para a realização do processo SSF, foram comparadas linhagens de leveduras das espécies S. cerevisiae (LBM-1, CAT-1 e PE- 2) e Kluyveromyces marxianus (UFV-3, ATCC 8554 e CCT 4086), quanto à utilização de fonte de carbono, tolerância a etanol e termotolerância, por meio da análise do perfil de crescimento e dos valores da velocidade específica de crescimento. De posse dos dados de temperatura máxima suportada pelas linhagens testadas, foram realizados ensaios de fermentação para estabelecer a quantidade ideal de inóculo a ser utilizada. Estes ensaios foram realizados utilizando glicose como substrato e em duas temperaturas diferentes, nas quais as leveduras tiveram um bom crescimento. Sabendo-se a concentração ideal de inóculo a ser utilizada procedeu-se à análise comparativa do rendimento fermentativo das linhagens testadas em processo SSF utilizando o bagaço de cana de açúcar como substrato. O seqüenciamento da região D1/D2 do DNA ribossomal confirmou que o isolado LBM-1 é uma linhagem de levedura pertencente à espécie S. cerevisiae. Os experimentos realizados mostraram que as linhagens de S.cerevisiae são mais tolerantes ao etanol, enquanto que as linhagens de K. marxianus são mais termotolerantes. Além disso, as linhagens de S. cerevisiae LBM-1, CAT-1 e PE-2 são termotolerantes e possuem a capacidade de crescer e fermentar a 42°C. Por meio da caracteriza ção fisiológica, foram estabelecidas duas temperaturas para a realização dos ensaios de fermentação, 37° e 42°C, nas quais todas as linhagens apresentaram um bom crescimento. Desta forma, foram feitos experimentos de fermentação em glicose comparando duas densidades óticas iniciais a 600 nm (D.O.(600)), 0,1 e 2, para saber qual seria a D.O.(600) ideal para iniciar a fermentação. Os resultados mostraram que uma D.O.(600) mais alta, correspondente a 2, favorece um aumento no rendimento do processo. Ensaios de fermentação em glicose a 37°C apresentaram valores de rendimentos em etanol próximos ao teórico 0,51. Nos ensaios de SSF com bagaço de cana de açúcar realizados tanto a 37°C, quanto a 42°C, foram obtid os rendimentos muito similares. Entretanto, a 37°C houve uma maior concentração fin al em etanol do que a 42°C. Além disso, os ensaios de SSF juntamente com dados obtidos anteriormente pelo grupo comprovaram que a fermentação deve ser iniciada após 72 horas de préhidrólise, uma vez que neste tempo ocorre inibição das celulases pelo produto. Com isto pode-se concluir que todas as linhagens testadas podem ser utilizadas para viabilizar o processo SSF.Item Estudos sobre a produção de etanol em células de Saccharomyces cerevisiae com maior atividade da enzima H+-ATPase de membrana citoplasmática.(Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós Graduação, Universidade Federal de Ouro Preto., 2013) Castanheira, Diogo Dias; Brandão, Rogélio LopesEtanol, uma fonte de energia renovável, pode ser considerado como uma boa alternativa para substituir os combustíveis fósseis. Atualmente, o continente americano é o maior produtor mundial de etanol, com Estados Unidos e Brasil sendo os maiores produtores mundiais. O objetivo deste trabalho foi estudar a produção de etanol em células de Saccharomyces cerevisiae com maior atividade da enzima H+-ATPase de membrana citoplasmática. Neste trabalho, inicialmente avaliou-se a produção de etanol em cepas de S. cerevisiae que apresentavam alteração na atividade da H+-ATPase de membrana citoplasmática, selecionando-se as cepas PJ69 (selvagem) e arg82Δ. As cepas foram transformadas com plasmídeos contendo o gene PMA1 (que codifica para a H+-ATPase) contendo modificações para tornar a enzima constitutivamente ativada. Nenhuma das cepas transformadas apresentou alteração quanto aos parâmetros de crescimento ou aumento da atividade enzimática. As cepas foram crescidas em meio contendo sacarose como fonte de carbono, em diferentes concentrações (2, 4, 8 e 15%). A cepa PJ69 apresentou uma maior produção de etanol e maior consumo de sacarose nas concentrações de 8 e 15% comparada à arg82Δ. O metabolismo de sacarose foi avaliado através da atividade invertásica e também pelo transporte desse açúcar. As cepas PJ69 e arg82Δ não diferiram com relação ao transporte de sacarose, entretanto a cepa selvagem mostrou maior atividade invertásica. A quantificação de ATP intracelular nas cepas PJ69 e arg82Δ crescidas em glicose mostrou que, na fase exponencial e na estacionária, a cepa arg82Δ contém seis vezes mais ATP que a cepa selvagem. Em sacarose, o conteúdo de ATP de arg82Δ também foi maior, sendo 1,1 e 1,5 vezes maior que a PJ69, nas fases exponencial e estacionária respectivamente. Em fermentação com alta concentração de glicose (15% p/v), as duas cepas produziram ao final do processo, concentrações similares de etanol, porém, a cepa arg82Δ levou o dobro do tempo da cepa PJ69 para atingir a mesma concentração de etanol.