PPBIOTEC - Programa de Pós-graduação em Biotecnologia
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Resultados da Pesquisa
Item Aumento da resistência ao estresse oxidativo induzido pelo extrato hidroalcoólico de carqueja (Baccharis trimera) no Caenorhabditis elegans : seria através de um mecanismo SKN-1/p38 MAPK e DAF-16 dependente?(Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós Graduação, Universidade Federal de Ouro Preto., 2011) Paiva, Franciny Aparecida; Oliveira, Riva de PaulaO alto consumo de comidas e bebidas ricas em flavonóides tem sido associado a um menor risco de doenças degenerativas crônicas como aterosclerose e câncer, devido tanto às suas atividades antioxidantes diretas de remoção de radicais livres, quanto à sua capacidade de atuar como antioxidante indireto ativando diferentes vias de sinalização em resposta ao estresse oxidativo. Baccharis trimera, conhecida como carqueja, é uma planta subarbustiva cujos extratos aquoso e hidroalcóolico são ricos em compostos antioxidantes tais como os ésteres do ácido quínico e os flavonóides nepetina, isoquercetina e quercetina. Recentemente, diversos estudos tem destacado as propriedades antioxidantes, anti-inflamatória, anti-proteolítica e anti-hemorrágica tanto em ensaios in vitro quanto in vivo. Neste projeto, nós investigamos o potencial antioxidante e pró-longevidade do extrato hidroalcóolico de carqueja (EHC) no organismo modelo Caenorhabiditis elegans. Para testar se o tratamento com o extrato hidroalcóolico de carqueja (EHC) aumenta a resistência ao estresse oxidativo, animais tipo selvagem foram tratados por 48 horas com 0,5, 5 e 50 mg/mL de EHC por 48 horas e depois submetidos ao estresse provocado por hidroperóxido de terc-butila (t-BOOH). O tratamento com 5 mg/ml aumentou significativamente a sobrevivência dos animais submetidos a 5 mM de t-BOOH. Embora o tratamento com 5 mg/ml por 48 horas ter aumentado a resistência ao estresse oxidativo, este mesmo tratamento não aumentou a resistência ao estresse térmico a 35 o C. O tratamento contínuo com 5 mg/ml de extrato de carqueja também não aumentou a longevidade dos animais tipo selvagem em condições normais. Apesar de apresentarem uma maior resistência ao estresse, os animais tratados com 5mg/ml do extrato de carqueja por 48 horas não apresentaram uma diferença significativa quanto aos marcadores bioquímicos (atividade da catalase) e indicadores de resistência (níveis de proteína carbonilada e sulfidrila totais) analisados em relação aos animais do grupo controle. Para averiguar se o aumento da resistência ao estresse oxidativo promovido pelo tratamento com extrato de carqueja depende da ativação dos fatores de transcrição SKN-1 e DAF-16, os ensaios de resistência ao estresse oxidativo foram repetidos usando mutantes de deleção ou “knockdown” para estes dois fatores. O tratamento com carqueja não aumentou a resistência ao estresse oxidativo dos mutantes skn-1(RNAi), sek-1 e daf-16. Por outro lado, também não foi observada a indução da localização nuclear nos animais tratados contendo gene repórter SKN-1::GFP e DAF-16::GFP. O presente trabalho sugere que EHC aumenta a resistência ao estresse oxidativo de uma maneira SKN/p38 MAPK e DAF-16 dependente. Porém, as análises de genes repórteres realizadas até o momento não corroboraram com estas observações.Item O envolvimento de SKN-1 na degradação proteica e formação de agregados poliglutamínicos no Caenorhabditis elegans.(Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós Graduação, Universidade Federal de Ouro Preto., 2013) Pereira, Valquiria Santos; Oliveira, Riva de PaulaO envelhecimento é um complexo processo que resulta em aumento da susceptibilidade a doenças e morte. O estresse oxidativo é parcialmente responsável pelo processo de envelhecimento, além de estar envolvido na formação de agregados proteicos que são causa de várias patologias relacionadas à senescência. O fator de transcrição SKN-1 está envolvido em vias de longevidade e resistência ao estresse em C. elegans, além de participar de vias de degradação de proteínas. O SKN-1 ativa 13 genes relacionados à agregação proteica sendo eles atp-5 fah-1, nekl-2, vha-6, vha-8, vha-12, vha-13, pas-4, pas-6, pbs-2, pbs-3, pbs-4, rpt-5. Neste projeto, nós investigamos o papel de SKN-1 na regulação de agregados proteicos e degradação de proteínas no C. elegans. Para averiguar a função, padrão de expressão e fenótipo RNAi desses genes nós utilizamos informações disponíveis no www.wormbase.org. Foi verificado que o os genes vha-6, vha-8, vha-12 e vha-13, pas-4, pas-6, pbs-2, pbs-3, pbs-4, e rpt-5 são relacionados à degradação proteica lisossomal ou proteassômica. Os genes vha-6, vha-12, vha-13 e fah-1 expressam a proteína GFP nas células do intestino e vha-8 e vha-13 são expressos nos neurônios ASI do C. elegans. O knockdown de cada um desses treze genes resulta em letalidade em algum estágio de desenvolvimento. Para avaliar se SKN-1 regula estes genes de forma direta nós fizemos uma busca por sítios de ligação ao SKN-1 na região promotora dos mesmos utilizando o software RSAT. Nossas análises revelaram que os genes pbs-2, pbs-4, fah-1, rpt-5 e vha-8 apresentam 1 sítio de ligação e que os genes nekl-2, pas-6, vha-13, pbs-3, pas-4, atp-5 e vha-6 apresentam de dois a quatro sítios de ligação ao SKN-1. Para testar se SKN-1 ativa a expressão desses genes nós analisamos os níveis relativos de mRNA de 8 deles submetidos a RNAi para skn-1 e observamos significativa redução na expressão de vha-8 e pas-4. Para investigar a relação de SKN-1 em vias de degradação proteica, medimos a atividade do proteassoma e observamos um aumento da atividade do proteassoma nos extratos proteicos dos animais tratados com skn-1(RNAi) em comparação com os tratados com controle(RNAi). Finalmente, avaliamos a formação de agregados proteicos em animais skn-1(RNAi) e controle (RNAi) e observamos que a ausência deste fator de transcrição resultou em um aumento do número de agregados proteicos no músculo e, por outro lado, numa diminuição do número de agregados em células intestinais.