PPBIOTEC - Programa de Pós-graduação em Biotecnologia
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Item Análise poligênica da tolerância ao alumínio em Saccharomyces cerevisiae por mapeamento de QTL.(2018) Mezadri, Hygor; Brandão, Rogélio Lopes; Thevelein, Johan; Dumortier, Françoise; Brandão, Rogélio Lopes; Rosa, Carlos Augusto; Tótola, Marcos Rogério; Cota, Renata Guerra de Sá; Freitas, Renata Nascimento deO bioetanol é um produto de grande importância econômica, principalmente devido a sua utilização como combustível renovável. A levedura Saccharomyces cerevisiae utiliza a sacarose obtida da cana-de-açúcar para produzir bioetanol por fermentação. Alguns fatores diminuem a capacidade fermentativa dessa levedura, por exemplo, a presença de Al3+ no caldo de cana-de-açúcar, levando a um aumento do tempo de fermentação e menor produção de bioetanol. Este trabalho teve como objetivo realizar a análise poligênica da tolerância ao alumínio em Saccharomyces cerevisiae utilizando a técnica de mapeamento de QTLs (Quantitative Trait Locus). Uma triagem entre 840 estirpes de leveduras isoladas de diferentes ambientes foi feita a fim de selecionar uma altamente tolerante ao alumínio. Dentre as estirpes testadas, a levedura denominada Bruggeman Fresh apresentou crescimento e melhor desempenho fermentativo em presença de 5 mM de Al2(SO4)3. A estirpe PE-2, amplamente utilizada na produção de etanol pela indústria brasileira, apresentou uma maior sensibilidade ao alumínio. Estas duas leveduras, Bruggeman Fresh e PE-2, foram escolhidas para a estratégia de análise poligênica para o fenótipo de resistência ao alumínio adotada neste estudo. Após esporulação e dissecação das tétrades, os parentais superior e inferior foram selecionados e cruzados dando origem ao híbrido diploide. Foi realizado um pré-teste em meio sólido contendo alumínio com 658 segregantes obtidos a partir desse híbrido diploide, sendo que 150 segregantes foram selecionados e submetidos ao teste fermentativo. A partir do teste da performance fermentativa em presença de Al2(SO4)3, 30 segregantes foram selecionados como fenótipo superior (alta tolerância ao alumínio). Foi realizada a extração do DNA genômico desses 30 segregantes agrupados e 120 segregantes não selecionados (agrupados randomicamente), assim como das estirpes parentais superior e inferior e sequenciadas. A partir das análises das sequências e mapeamento de QTL foi encontrada uma região no cromossomo VI com grande ligação ao fenótipo de interesse, observado devido à diferença na frequência dos SNPs entre os grupos selecionado e não selecionado. Após a análise de reciprocidade hemizigótica, foi identificado que o gene FAB1 tem um importante papel sobre a tolerância ao alumínio em S. cerevisiae.Item Análises genômicas para otimização da produção de compostos aromatizantes por estirpe de Saccharomyces cerevisiae isolada de produção de cachaça.(2018) Araújo, Thalita Macedo; Brandão, Rogélio Lopes; Diniz, Raphael Hermano Santos; Mendes, Tiago Antônio de Oliveira; Borges, William de Castro; Fietto, Luciano Gomes; Brandão, Rogélio Lopes; Andrade, Milton Hércules Guerra deA qualidade das bebidas alcoólicas está intimamente relacionada à presença de concentrações equilibradas de compostos voláteis, subprodutos do processo de fermentação alcoólica e altamente influenciados pela linhagem da levedura utilizada de tal modo que a compreensão das bases moleculares da produção de compostos desejáveis represente a possibilidade do incremento da qualidade de bebidas fermentadas visando a agregação de valor ao produto final. O presente trabalho tem como objetivo realizar uma análise de características genéticas e fisiológicas das leveduras isoladas da produção de cachaça com potencial para aplicação na produção de outras bebidas alcoólicas. Desse modo, 118 linhagens da coleção LBCM foram avaliadas quanto a capacidade de metabolização de maltose, produção de baixas concentrações de sulfeto de hidrogênio, capacidade de transporte de maltotriose e capacidade de produção de compostos voláteis. A despeito de sua origem comum, as leveduras avaliadas apresentaram diferenças significativas em sua fisiologia. Algumas dessas leveduras apresentam potencial biológico para aplicação na produção de outras bebidas, como, por exemplo, cerveja. A linhagem LBCM1073 foi selecionada dentre as demais por ser heterotálica e pela sua capacidade de produção de acetato de isoamila, um éster altamente desejável em diversas bebidas alcoólicas. Após sequenciamento genômico dessa levedura, com cobertura de 263 vezes e a predição de 5686 genes, análises de genômica comparativa revelaram que a linhagem LBCM1073 apresenta um conjunto de 24 genes ausentes na linhagem laboratorial S. cerevisiae S288c. Alguns desses genes apresentam similaridade com S. bayanus e Lachancea sp. Um total de 64,15% dos genes da linhagem LBCM1073 apresenta ortólogos com genes de 40 ascomicetos avaliados. Dentre as vias já mencionadas na literatura como relacionadas à produção de compostos voláteis, a via de sinalização mTOR e a glicólise, são as que apresentaram maior percentual de genes ortólogos, justificado pela ampla distribuição dessas duas vias dentre os organismos utilizados para análise. Ao serem comparadas as sequências de aminoácidos de 34 enzimas,relacionadas à produção de compostos responsáveis por aromas, 13 foram idênticas entre LBCM1073 e S. cerevisiae S288c. Para as demais, as proteínas codificadas por LEU4, PMA1, RSP5, TOR1 e FAS2 não apresentaram as substituições descritas na literatura como relacionadas à maior produção de compostos on flavour. Em conjunto, esses dados mostram que LBCM1073 e S. cerevisiae S288c apresentam diversas distinções a nível genômico. Uma metodologia capaz de contribuir para melhor elucidar essas diferenças em relação à produção de compostos secundários à fermentação é a técnica de BSA (Bulked Segregants Analisys) ou análise de agrupamentos de segregantes. As análises fenotípicas de segregantes obtidos do cruzamento entre LBCM1073 e S. cerevisiae S288c revelou uma discreta relação direta entre a capacidade de conversão de álcool isoamílico em acetato de isoamila e o crescimento na presença de TFL 0,5 mM. Além disso, os segregantes já obtidos e avaliados poderão ser empregados na análise de QTLs envolvidos na produção de acetato de isoamila.Item Envolvimento do íon cálcio na resposta ao estresse ácido em Saccharomyces cerevisiae.(2014) Almeida, Marcos Vinicius Simi; Castro, Ieso de MirandaPara manter sua capacidade produtiva, as células de leveduras precisam adaptar-se às mudanças ambientais que ocorrem durante o processo produtivo. A resposta a baixo pH é de interesse, pois tal exposição ocorre sob condições industriais como no tratamento ácido para redução de contaminação bacteriana antes da reciclagem celular em processos fermentativos. Semelhante à resposta a ácidos orgânicos, a resistência a ácidos inorgânicos envolve mudanças da permeabilidade de membrana, extrusão ativa de H+ e modulação da expressão gênica. O presente trabalho estudou a participação do íon cálcio na resposta ao estresse ácido na levedura Saccharomyces cerevisiae. Os resultados obtidos mostram elevação transitória dos níveis citoplasmáticos de Ca2+ desencadeada por pulso ácido e que esta mudança decorre do influxo de cálcio extracelular e da mobilização vacuolar do íon. Testes de viabilidade celular sugerem que a tolerância da S. cerevisiae a estresse ácido envolve a ativação da via de sinalização da calcineurina dependente de Ca2+/calmodulina e consequente regulação da expressão de alguns genes mediada pelo fator de transcrição Crz1p/Tcn1p. A tolerância dos mutantes nulos da via de sinalização da quinase Snf1p, responsável pela utilização de fontes alternativas de carbono, foi menor em relação à cepa parental BY4741, sugerindo a participação desta via na resposta a baixo pH. Em conjunto, os resultados mostram a importância das vias de sinalização da fosfatase calcineurina e da quinase Snf1p para a resposta da S. cerevisiae a estresse ácido.Item Caracterização bioquímico-molecular de cepas de Saccharomyces cerevisiae isoladas de dornas de fermentação de cachaça para produção de cervejas.(Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós Graduação, Universidade Federal de Ouro Preto., 2013) Araújo, Thalita Macedo; Brandão, Rogélio LopesA cerveja é uma bebida alcoólica produto da fermentação do malte de cevada por leveduras que vem sendo produzida desde, aproximadamente, 6000 anos a.C. Além de gás carbônico e etanol, as leveduras produzem durante a fermentação, compostos secundários que são responsáveis pela formação do flavour e consequente qualidade sensorial da bebida. Por isso o uso de leveduras selecionadas tem sido um aspecto de grande importância na obtenção de bebidas. Na fabricação da cerveja, podem ser utilizadas leveduras do tipo ale ou lager, que pertencem à espécie Saccharomyces cerevisiae e Saccharomyces pastorianus, respectivamente. Estas espécies podem ser classificadas tanto por testes bioquímicos quanto por seu comportamento diferencial durante a fermentação. O Laboratório de Biologia Celular e Molecular (LBCM) do Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas (NUPEB) da UFOP conta com uma coleção de cepas de Saccharomyces cerevisiae isoladas a partir de dornas de fermentação de cachaça, as quais foram selecionadas por sua alta capacidade de produção de compostos voláteis e alta resistência a diferentes tipos de estresse. O presente trabalho objetivou a caracterização bioquímica e molecular de 21 cepas da coleção LBCM e a utilização de critérios de seleção visando à aplicação destas cepas à produção de cervejas. Das 21 cepas estudadas, 11 foram capazes de fermentar maltose, apresentando velocidade específica de crescimento semelhante em meio contendo glicose. A identificação molecular das cepas através da região ITS-5.8S do rDNA confirmou que 10 cepas pertencem à espécie S. cerevisiae. Dois grupos de testes foram aplicados posteriormente sobre as 10 cepas selecionadas e 4 cepas cervejeiras comerciais. O primeiro grupo de testes incluiu critérios de seleção baseados na classificação ale e lager, no perfil de floculação e na capacidade de crescer sob baixas temperaturas. O segundo grupo, incluiu testes complementares baseados na tolerância ao etanol, na produção de sulfeto de hidrogênio (H2S) e 4-vinilguaiacol (4-VG), no transporte de α-glicosídeos e na síntese de micocinas. Os resultados mostraram que três das 10 cepas estudadas foram capazes de fermentar melobiose e secretar melobiase, perfil característico de cepas tipo lager, embora todas as cepas tenham crescido a 37°C. Além disso, 9 foram capazes de crescer a 20°C e 7 a 15°C. Quanto ao perfil de floculação, 9 cepas apresentaram percentuais de floculação maior que 36% e responderam com um fenótipo New-Flo. A presença dos genes FLO1, FLO5 e FLO11 foi verificada por PCR e quantificada por qPCR, sendo relevante a presença dos genes FLO5 e FLO11 na maioria das cepas. Em geral, as cepas mais floculantes foram também as que apresentaram maior hidrofobicidade na sua superfície celular. Quanto aos testes complementares, as cepas apresentaram resistência a altas concentrações de etanol (20% (v/v)), baixa ou nenhuma produção de H2S (off flavour) e síntese de 4-VG em concentrações semelhantes às apresentadas pelas cepas comerciais tipo ale. Considerando a importância do consumo total dos açúcares presentes no mosto, em especial a maltotriose, o transporte de α-glicosídeos foi avaliado. As cepas apresentaram um transporte de α-glicosídeos semelhante aos valores revelados pelas cepas cervejeiras comerciais. Finalmente, as cepas foram submetidas a testes de produção e resistência a micocinas, considerando o uso de fermentações consorciadas. Os resultados revelaram que todas as cepas experimentais não são sensíveis, tampouco prejudiciais a outras espécies. Com base nos resultados dos testes complementares, foram selecionadas as cepas experimentais LBCM 45 e 78 para a produção de cervejas german pilsner e weissbier, respectivamente. As cervejas produzidas foram submetidas a análises físico-químicas, cujos resultados mostraram que as cepas em estudo, LBCM 45 e 78 apresentaram comportamento semelhante às cepas cervejeiras comerciais W-34/70 e WB-06. Portanto, os resultados do presente trabalho contribuíram para uma melhor caracterização da grande diversidade de linhagens de S. cerevisiae isoladas da produção de cachaça, visando sua potencial utilização na produção de outras bebidas alcoólicas fermentadas, tais como as cervejas, além da sua possível utilização em fermentações consorciadas.Item Estudos sobre a produção de etanol em células de Saccharomyces cerevisiae com maior atividade da enzima H+-ATPase de membrana citoplasmática.(Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós Graduação, Universidade Federal de Ouro Preto., 2013) Castanheira, Diogo Dias; Brandão, Rogélio LopesEtanol, uma fonte de energia renovável, pode ser considerado como uma boa alternativa para substituir os combustíveis fósseis. Atualmente, o continente americano é o maior produtor mundial de etanol, com Estados Unidos e Brasil sendo os maiores produtores mundiais. O objetivo deste trabalho foi estudar a produção de etanol em células de Saccharomyces cerevisiae com maior atividade da enzima H+-ATPase de membrana citoplasmática. Neste trabalho, inicialmente avaliou-se a produção de etanol em cepas de S. cerevisiae que apresentavam alteração na atividade da H+-ATPase de membrana citoplasmática, selecionando-se as cepas PJ69 (selvagem) e arg82Δ. As cepas foram transformadas com plasmídeos contendo o gene PMA1 (que codifica para a H+-ATPase) contendo modificações para tornar a enzima constitutivamente ativada. Nenhuma das cepas transformadas apresentou alteração quanto aos parâmetros de crescimento ou aumento da atividade enzimática. As cepas foram crescidas em meio contendo sacarose como fonte de carbono, em diferentes concentrações (2, 4, 8 e 15%). A cepa PJ69 apresentou uma maior produção de etanol e maior consumo de sacarose nas concentrações de 8 e 15% comparada à arg82Δ. O metabolismo de sacarose foi avaliado através da atividade invertásica e também pelo transporte desse açúcar. As cepas PJ69 e arg82Δ não diferiram com relação ao transporte de sacarose, entretanto a cepa selvagem mostrou maior atividade invertásica. A quantificação de ATP intracelular nas cepas PJ69 e arg82Δ crescidas em glicose mostrou que, na fase exponencial e na estacionária, a cepa arg82Δ contém seis vezes mais ATP que a cepa selvagem. Em sacarose, o conteúdo de ATP de arg82Δ também foi maior, sendo 1,1 e 1,5 vezes maior que a PJ69, nas fases exponencial e estacionária respectivamente. Em fermentação com alta concentração de glicose (15% p/v), as duas cepas produziram ao final do processo, concentrações similares de etanol, porém, a cepa arg82Δ levou o dobro do tempo da cepa PJ69 para atingir a mesma concentração de etanol.