PPBIOTEC - Programa de Pós-graduação em Biotecnologia

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Resultados da Pesquisa

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    Identificação de genes envolvidos na tolerância ao alumínio em Saccharomyces cerevisiae.
    (2022) Ferreira, Ludmila da Conceição; Cruz, Izinara Rosse da; Brandão, Rogélio Lopes; Cunha, Aureliano Claret da; Cruz, Izinara Rosse da; Brandão, Rogélio Lopes; Cunha, Aureliano Claret da; Magalhães, Cíntia Lopes de Brito; Santos, Fernanda Godoy
    A produção de etanol combustível representa um importante papel na economia de vários países, sendo os Estados Unidos, Brasil e China os maiores produtores mundiais. O bioetanol é um combustível renovável, sendo o biocombustível mais consumido no Brasil. A síntese do etanol é normalmente realizada com a obtenção de uma solução de açúcares, que são fermentados para produzir etanol, sendo este separado por destilação e purificado. A principal rota metabólica envolvida na fermentação alcoólica em leveduras é a glicólise. Diversos fatores fisiológicos podem influenciar no desempenho fermentativo da Saccharomyces cerevisiae, como o estresse osmótico, o estresse ácido, a contaminação bacteriana e a presença de níveis tóxicos de alumínio. Em virtude da fermentação ocorrer em condições ácidas, o alumínio, absorvido pela cana-de-açúcar em solos ácidos, provoca sérios problemas durante a fermentação. As cepas de leveduras industriais diferem bastante em relação à tolerância ao alumínio e, considerando o potencial de aplicação biotecnológica das leveduras, se faz necessário um estudo das bases genéticas envolvidas nesse fenótipo de tolerância. Neste contexto, o objetivo do presente projeto foi identificar no genoma da Saccharomyces cerevisiae genes que possam estar envolvidos na tolerância ao alumínio. Desse modo, localizou-se os genes presentes na região do QTL no cromossomo VI apontados por Mezadri (2018), envolvidos na tolerância ao alumínio em S. cerevisiae e avaliou-se a tolerância ao alumínio por meio de testes de crescimento contendo diferentes concentrações de alumínio. Para verificar se os genes candidatos a estarem envolvidos com a tolerância ao alumínio carregavam variantes genéticas que poderiam estar associadas ao fenótipo de interesse, as sequências de nucleotídeos desses genes foram alinhadas utilizando a ferramenta online Clustal Omega, para visualização e análise do alinhamento múltiplo das sequencias de nucleotídeos utilizou-se o programa Jalview 2 e para visualização das variantes genéticas utilizou-se a ferramenta IGV. Nossos resultados indicaram envolvimento de 18 genes com a tolerância ao alumínio e três tipos variantes genéticas sendo elas sinônima, missense e sem sentido, que permitem estudo de modificação de SNV. Além disso, nossos resultados fornecem dados promissores para melhoramento de cepas industriais para produção de bioetanol.
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    Análise de QTL e gênomica comparativa para estudar mecanismos regulatórios da H+ -ATPASE de membrana plasmática de Saccharomyces cerevisiae.
    (2021) Barbosa, Patrícia Gonçalves Prates; Brandão, Rogélio Lopes; Cunha, Aureliano Claret da; Cruz, Izinara Rosse da; Brandão, Rogélio Lopes; Fietto, Luciano Gomes; Mendes, Tiago Antônio de Oliveira; Andrade, Milton Hércules Guerra de; Silva, Silvana de Queiroz
    A H+ -ATPase é uma proteína presente na membrana citoplasmática de plantas e fungos e desempenha um papel essencial na geração de um gradiente eletroquímico de prótons, importante para a captação de nutrientes e regulação do pH intracelular. A ativação da H + -ATPase da membrana citoplasmática em Saccharomyces cerevisiae induzida por glicose é supostamente atribuída a um sinal de cálcio intracelular correlacionado ao metabolismo do fosfatidilinositol. Em estudos anteriores do nosso grupo de pesquisa, foi observada diferença de fenótipo entre as cepas S. cerevisiae BY4742 arg82Δ e PJ69 arg82Δ através do teste de atividade da H + -ATPase, indicando que o fenótipo de maior ativação da H + -ATPase está relacionado a vários genes. Diante do exposto, o objetivo deste trabalho foi utilizar diferentes abordagens genômicas para identificar novos componentes da regulação induzida por glicose da H + -ATPase. Para isso, foram realizados o sequenciamento do genoma segregante agrupado, mapeamento de QTLs e análises de Bioinformática para identificar o possível motivo da diferença de fenótipo e, ou, novos componentes desta via de transdução de sinal. Uma vez identificadas as variantes na análise de mapeamento de QTL foi desenvolvido o script SNPsInQTLselection.py para identificar as bases genéticas que podem estar envolvidas com o fenótipo de maior atividade da H+ -ATPase. Após a utilização desse script foram identificadas 42 variantes em 33 genes potencialmente envolvidos com o fenótipo de interesse. Para priorização desses genes candidatos foi realizado análise de enriquecimento e interatoma que permitiram identificar 10 genes enriquecidos e envolvidos na via da telomerase e do fosfatidilinositol (STT4, PIK2, UGA2, EST1, MEC3, HEK2, TOP3, PSO2, STO1, FUR4). Cepas do background BY contendo essesrespectivos genes deletados (coleção EUROSCARF) foram utilizadas para teste de fenótipo de acidificação extracelular e sinalização de cálcio induzida por glicose. Por meio desses testes, 4 (UGA2, FUR4, EST1 e STT4) dos 10 genes enriquecidos, apresentaram o fenótipo de maior ativação da H+ -ATPase, fenótipo esse evidenciado nos testes de acidificação extracelular e sinal de cálcio. Destes 4 genes, vale destacar o STT4 visto que, de acordo com a função descrita para esse gene na literatura o fosfatidilinositol-4-fosfato pode exercer um papel na regulação da via de ativação de H + -ATPase, controlando a atividade da fosfolipase C. Tendo em vista uma relação positiva entre atividade da H + - ATPase e desempenho fermentativo, estudos futuros podem ser feitos com os genes/alelos identificados neste trabalho, com aplicação em cepas de leveduras industriais visando a melhoria na eficiência de processos fermentativos. Os genes (UGA2, FUR4, EST1 e STT4) merecem investigação detalhada para verificação do possível envolvimento na via de sinalização da H+ -ATPase. Esse trabalho apresenta pela primeira vez uma estratégia de Bioinformática para identificar genes candidatos quando o resultado do mapeamento de QTL não for significativo.
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    Caracterização de leveduras termotolerantes para produção de etanol celulósico.
    (Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós Graduação, Universidade Federal de Ouro Preto., 2011) Costa, Daniela Arruda; Fietto, Luciano Gomes
    A conversão de material lignocelulósico em açúcares fermentáveis é considerada uma alternativa promissora para aumentar a produção de etanol. Neste contexto tem sido demonstrado que maiores rendimentos em etanol são obtidos por meio do acoplamento das etapas de sacarificação e fermentação, processo chamado sacarificação e fermentação simultâneas (SSF). No entanto, um dos entraves do processo é a temperatura ótima para a realização das duas etapas; uma vez que, a ação ótima das celulases ocorre em torno de 50°C, e nquanto que a maioria dos organismos fermentativos cresce entre 30° e 37°C. Com o objetivo de viabilizar o processo SSF foi isolada e identificada uma linhagem termotolerante de Saccharomyces cerevisiae, denominada LBM-1. A fim de selecionar o microorganismo adequado e as condições ideais para a realização do processo SSF, foram comparadas linhagens de leveduras das espécies S. cerevisiae (LBM-1, CAT-1 e PE- 2) e Kluyveromyces marxianus (UFV-3, ATCC 8554 e CCT 4086), quanto à utilização de fonte de carbono, tolerância a etanol e termotolerância, por meio da análise do perfil de crescimento e dos valores da velocidade específica de crescimento. De posse dos dados de temperatura máxima suportada pelas linhagens testadas, foram realizados ensaios de fermentação para estabelecer a quantidade ideal de inóculo a ser utilizada. Estes ensaios foram realizados utilizando glicose como substrato e em duas temperaturas diferentes, nas quais as leveduras tiveram um bom crescimento. Sabendo-se a concentração ideal de inóculo a ser utilizada procedeu-se à análise comparativa do rendimento fermentativo das linhagens testadas em processo SSF utilizando o bagaço de cana de açúcar como substrato. O seqüenciamento da região D1/D2 do DNA ribossomal confirmou que o isolado LBM-1 é uma linhagem de levedura pertencente à espécie S. cerevisiae. Os experimentos realizados mostraram que as linhagens de S.cerevisiae são mais tolerantes ao etanol, enquanto que as linhagens de K. marxianus são mais termotolerantes. Além disso, as linhagens de S. cerevisiae LBM-1, CAT-1 e PE-2 são termotolerantes e possuem a capacidade de crescer e fermentar a 42°C. Por meio da caracteriza ção fisiológica, foram estabelecidas duas temperaturas para a realização dos ensaios de fermentação, 37° e 42°C, nas quais todas as linhagens apresentaram um bom crescimento. Desta forma, foram feitos experimentos de fermentação em glicose comparando duas densidades óticas iniciais a 600 nm (D.O.(600)), 0,1 e 2, para saber qual seria a D.O.(600) ideal para iniciar a fermentação. Os resultados mostraram que uma D.O.(600) mais alta, correspondente a 2, favorece um aumento no rendimento do processo. Ensaios de fermentação em glicose a 37°C apresentaram valores de rendimentos em etanol próximos ao teórico 0,51. Nos ensaios de SSF com bagaço de cana de açúcar realizados tanto a 37°C, quanto a 42°C, foram obtid os rendimentos muito similares. Entretanto, a 37°C houve uma maior concentração fin al em etanol do que a 42°C. Além disso, os ensaios de SSF juntamente com dados obtidos anteriormente pelo grupo comprovaram que a fermentação deve ser iniciada após 72 horas de préhidrólise, uma vez que neste tempo ocorre inibição das celulases pelo produto. Com isto pode-se concluir que todas as linhagens testadas podem ser utilizadas para viabilizar o processo SSF.