PPBIOTEC - Programa de Pós-graduação em Biotecnologia
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Resultados da Pesquisa
Item Inovações na produção de enzimas do fungo Chrysoporthe cubensis e seus reflexos na sacarificação do bagaço de cana-de-açúcar.(2018) Albuquerque, Mariana Furtado Granato de; Rezende, Sebastião Tavares de; Guimarães, Valéria Monteze; Rezende, Sebastião Tavares de; Almeida, Maíra Nicolau de; Andrade, Milton Hércules Guerra de; Monteiro, Paulo Sérgio; Brandão, Rogélio LopesO presente trabalho avaliou o efeito de métodos de pré-tratamento, ainda não testados, na hidrólise do bagaço de cana realizada com coquetéis enzimáticos fúngicos produzidos on-site. Além disso, o extrato enzimático de C. cubensis foi melhorado, por meio de alterações em suas condições de cultivo, e as enzimas α-arabinofuranosidases desse fungo foram purificadas, caracterizadas e avaliadas na hidrólise do bagaço de cana-de-açúcar pré-tratado alcalino. Os melhores resultados mostraram que o prétratamento hidrotérmico permitiu a conversão de mais de 60% da glicana pelo blend enzimático C. cubensis-P.pinophilum, além de diminuir a necessidade de hemicelulases no processo. O farelo de trigo se destacou, em relação ao capim elefante e ao bagaço de cana-de-açúcar, como fonte de carbono no crescimento do C. cubensis. O melhor extrato enzimático, obtido a partir do crescimento do fungo em uma mistura do farelo de trigo e farinha de beterraba, na proporção 1:1, se mostrou mais completo e eficiente na sacarificação do bagaço de cana submetido ao pré-tratamento ácido ou alcalino, se comparado ao extrato enzimático obtido com farelo de trigo puro. A partir desse coquetel, foram purificadas e caracterizadas duas α-arabinofuranosidases, denominadas α-Ara1 e α-Ara2. As duas enzimas foram satisfatoriamente estáveis a 50 °C, com meiavidas de 68 e 77 horas, respectivamente, e apresentaram pH e temperatura ótimos próximos a 4,0 e 60 °C. A α-Ara1 foi identificada como membro da família GH51 e a αAra2 como uma GH54. Se comparada à α-Ara1, α-Ara2 apresentou maior atividade específica em diferentes substratos, além de maiores eficiências catalíticas ao atuar sobre substratos naturais e complexos, provavelmente devido à presença do domínio de ligação à carboidrato CBM42, presente na estrutura desse enzima. A suplementação do coquetel comercial Multifect® CL com a α-Ara2 aumentou 1,6 vezes e liberação de glicose e 3,6 vezes a produção de xilose. Resultado idêntico foi observado após a combinação do coquetel comercial com as duas α-arabinofuranosidases purificadas, o que indicou sinergismo entre as mesmas. Portanto, o presente estudo contribui para maior conhecimento dos efeitos de diferentes pré-tratamentos na atuação das enzimas produzidas por C. cubensis, bem como traz algumas inovações relacionadas ao processo de produção de enzimas desse fungo e ao estudo de novas α-arabinofuranosidases com potencial para aplicação na indústria de etanol lignocelulósico.Item Avaliação do potencial celulolítico e fermentativo de bactérias do gênero Clostridium e da microbiota autóctone na fermentação do bagaço de cana bruto.(2019) Menegatto, Marília Bueno da Silva; Silva, Silvana de Queiroz; Silva, Silvana de Queiroz; Gurgel, Leandro Vinícius Alves; Silveira, Wendel Batista daO bagaço de cana-de-açúcar é um subproduto agrícola considerado fonte renovável, barata e abundante em açúcares, potencialmente utilizado como matéria prima na produção sustentável de combustíveis e insumos químicos no conceito de biorrefinaria, entretanto esbarra na dificuldade de acesso aos açúcares pelos microrganismos. A utilização de bactérias produtoras de enzimas hidrolíticas aparece como alternativa na desestruturação da biomassa e fermentação dos açúcares, como as do gênero Clostridium. Sendo assim, o trabalho teve como objetivo avaliar o potencial hidrolítico e fermentativo de bactérias do gênero Clostridium, e de microrganismos autóctones na fermentação do bagaço de cana bruto. As bactérias foram isoladas a partir do enriquecimento anaeróbio do bagaço (inoculado com estrume bovino e lodo de reator anaeróbio), e caracterizadas quanto à morfologia, parede celular e produção de celulase. Os ensaios de fermentação semi-sólida do bagaço de cana bruto foram realizados com os isolados que apresentaram produção de celulase e monitorados por 192h a 37°C. Também foi monitorado o perfil fermentativo dos microrganismos autóctones através de um ensaio sem adição de inóculo. A fração líquida foi analisada para determinação da concentração dos açúcares e metabólitos e o resíduo sólido caracterizado para determinação de celulose e açúcares antes e depois dos ensaios. Dentre os isolados estudados, as culturas denominadas 10, 8 e 3 apresentaram os maiores índices enzimáticos (1,67, 1,17 e 1,11 respectivamente) e também a maior capacidade de hidrólise e remoção dos açúcares da fração celulósica e hemicelulósica no ensaio fermentativo. Os metabólitos de maior produção foram o ácido acético (~ 1,3 g/L) pela microbiota autóctone e na presença dos isolados 3 e 8; a máxima concentração de acetona (~ 500 mg/L) e do ácido butírico (~ 300 mg/L) foi observada na presença da bactéria 7, sendo esta, portanto importante na realização do metabolismo solvetogênico. Apesar dos isolados 3 e 8 terem produzido concentração similar de ácido acético detectado no ensaio não inoculado, observou-se um incremento na hidrólise da biomassa e na produção de ácido butírico nos ensaios inoculados. Sendo assim, tanto a microbiota autóctone quanto as bactérias 3 e 8 potencialmente do gênero Clostridium, são capazes de hidrolisar o bagaço de cana bruto e fermentar os açúcares lignocelulósicos a ácido acético, acetona e ácido butírico.Item Produção e caracterização de xilanases derivadas do gene xynA de Orpinomyces PC-2 e avaliação da eficiências na hidrólise de farinha e clarificação de sucos.(2014) Passarinho, Amanda Tafuri Paniago; Guimarães, Valéria MontezeA endo-1,4-β-xilanase (E.C. 3.2.1.8) é a principal constituinte do sistema enzimático xilanolítico devido à sua atuação na hidrólise da xilana, o segundo polissacarídeo mais abundante na parede celular de plantas. Neste trabalho, duas xilanases recombinantes, uma com as mutações V135A e A226T (XM) e outra sem mutações (XNM), derivadas do gene xynA de Orpinomyces, foram expressas em E. coli, purificadas e caracterizadas bioquímica e cineticamente com o substrato arabinoxilana de trigo, visando aplicações na tecnologia de alimentos. A produção da enzima em E. coli/pET24b foi feita em meios LB e SOB/kan, usando IPTG como indutor. As enzimas foram purificadas em cromatografia de troca iônica (Q-Sepharose) e apenas uma banda de 25 kDa, correspondente as xilanases, foi visualizada em SDS-PAGE. As atividades específicas, após purificação, foram de 12844 U mg-1 para a XNM, e de 10794 U mg -1 para a XM. As condições ótimas para XNM foram de 60 oC e pH entre 4,5 e 7,0, meia vida de 220 min a 50 oC e de 31 min a 60 oC, ambos em pH 6,5. Os valores de Km, Kcat e Ea foram de 0,0021 mg mL-1, 2,31x106 s-1 e 32,9 kJ mol-1, respectivamente. Já XM manteve a temperatura ótima de 60 oC e exibiu maior estabilidade na faixa de pH de 3 a 8, e meia vida de 440 e 71 min a 50 oC e 60 oC, respectivamente. Os valores de Km, Kcat e Ea foram 0,0014 mg mL-1, 3,29x106 s-1 e 43,9 kJ mol-1, respectivamente. Os ensaios de hidrólise da farinha de trigo integral (10 % p/v) foram conduzidos a 27 oC, 100 rpm, 6h, utilizando 50 U de XNM e 20U de XM/g farinha e a quantificação de xilose liberada foi feita em HPLC. Enquanto que nos ensaios conduzidos a 27 oC não houve liberação de xilose a partir da farinha de trigo, nos ensaios a 50 oC foram detectados 2,38 e 1,55 mg xilose/g farinha com o uso de XNM e XM, respectivamente. Nos ensaios de clarificação do suco de maçã, feita com 50 U/mL de XNM e XM, a 60 oC, 100 rpm, 60 min, foi observada liberação extremamente reduzida de xilose. Assim, para maior eficiência desse processo sugere-se a utilização conjunta de xilanase e pectinases.