PPBIOTEC - Programa de Pós-graduação em Biotecnologia
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Resultados da Pesquisa
Item Estudos sobre consumo de glicerol por leveduras para fins biotecnológicos.(2019) Cunha, Aureliano Claret da; Brandão, Rogélio Lopes; Santos, Fernanda Godoy; Lucas, Cândida Manuel Ribeiro Simões; Brandão, Rogélio Lopes; Tótola, Marcos Rogério; Freitas, Renata Nascimento de; Silva, Silvana de Queiroz; Mendes, Tiago Antônio de OliveiraNos últimos anos o aumento do excedente de produção do glicerol bruto, um subproduto da produção do biodiesel, tem estimulado a busca por processos alternativos de aplicação do glicerol. De entre as alternativas, destacam-se os processos biotecnológicos onde o glicerol é convertido por microrganismos em um produto com maior valor agregado, de amplo uso industrial e com menor impacto ambiental. O objetivo do presente trabalho foi caracterizar Wickerhamomyces anomalus LBCM1105, uma cepa capaz de utilizar eficientemente o glicerol como única fonte de carbono, através do isolamento e caracterização do transportador de alta afinidade de glicerol (WaStl1p), e do sequenciamento do seu genoma. Estratégias de engenharia genética foram também utilizadas em Saccharomyces cerevisiae BY4741, com intuito de otimizar o consumo de glicerol e obter a sua conversão em etanol. LBCM1105 apresentou velocidades de crescimento maiores que BY4741 independente do meio (YP ou YNB) e da fonte de carbono (glicose ou glicerol). Com o objetivo de melhorar o desempenho de BY4741 em glicerol, foi tentada a sobrexpressão simultânea do transportador ativo de glicerol Stl1 e da primeira enzima da assimilação do glicerol, a glicerol quinase Gut1, com vista a aumentar o fluxo metabólico de consumo do glicerol. Adicionalmente foi também sobrexpresso o fator de transcrição/ativador Pdc2 que controla vários genes, incluindo PDC1, PDC10 e THI10, com vista a promover o desvio do fluxo glicolítico para a fermentação. Todas as construções foram confirmadas por amplificação de fragmentos alvo e sequenciamento de DNA. O desempenho final de cada mutante foi avaliado, não tendo sido obtido o efeito esperado. A taxa de crescimento foi tanto menor quanto mais modificações genéticas, sugerindo uma diminuição de fitness proporcional. Em colaboração com o Laboratório Nacional de Ciência e Tecnologia do Bioetanol (CTBE), o genoma da LBCM1105 foi sequenciado, montado, anotado e submetido a análises filogenéticas multiloci. O genoma da W. anomalus LBCM1105 apresenta 12,78 Mb, com %CG de 34,52, cobertura de 20,5x em profundidade e 90% de extensão e completude. Comparando com leveduras conhecidas, o genoma contém todas as sequências de proteínas relacionadas ao transporte e metabolismo de glicerol. O gene WaSTL1 foi isolado por PCR e clonado no vetor (pCev-G2-Km). O mutante S. cerevisiae BY4741 stl1Δ foi transformado com a construção. A caracterização do mecanismo de transporte de glicerol confirmou (i) que WaStl1p tem uma elevada afinidade para o glicerol, Km = 0,96 ± 0,15 mM, (ii) que a cepa LBCM1105 apresenta além da afinidade uma elevada quantidade de transportador ativo, Vmax = 148,3 ± 10,16 μmol·h−1·g−1, e (iii) que o gene expresso heterologamente em S. cerevisiae stl1Δ complementa o mutante. O caráter ativo do transporte foi confirmado pela sensibilidade ao protonionóforo carbonil cianeto m-clorofenilhidrazona, tanto na LBCM1105 como na S. cerevisiae stl1Δ WaSTL1. Futuros estudos das vias metabólicas de glicerol em leveduras serão necessários para que novas estratégias de engenharia genética sejam mais eficientes.Item Estudos sobre a produção de etanol em células de Saccharomyces cerevisiae com maior atividade da enzima H+-ATPase de membrana citoplasmática.(Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós Graduação, Universidade Federal de Ouro Preto., 2013) Castanheira, Diogo Dias; Brandão, Rogélio LopesEtanol, uma fonte de energia renovável, pode ser considerado como uma boa alternativa para substituir os combustíveis fósseis. Atualmente, o continente americano é o maior produtor mundial de etanol, com Estados Unidos e Brasil sendo os maiores produtores mundiais. O objetivo deste trabalho foi estudar a produção de etanol em células de Saccharomyces cerevisiae com maior atividade da enzima H+-ATPase de membrana citoplasmática. Neste trabalho, inicialmente avaliou-se a produção de etanol em cepas de S. cerevisiae que apresentavam alteração na atividade da H+-ATPase de membrana citoplasmática, selecionando-se as cepas PJ69 (selvagem) e arg82Δ. As cepas foram transformadas com plasmídeos contendo o gene PMA1 (que codifica para a H+-ATPase) contendo modificações para tornar a enzima constitutivamente ativada. Nenhuma das cepas transformadas apresentou alteração quanto aos parâmetros de crescimento ou aumento da atividade enzimática. As cepas foram crescidas em meio contendo sacarose como fonte de carbono, em diferentes concentrações (2, 4, 8 e 15%). A cepa PJ69 apresentou uma maior produção de etanol e maior consumo de sacarose nas concentrações de 8 e 15% comparada à arg82Δ. O metabolismo de sacarose foi avaliado através da atividade invertásica e também pelo transporte desse açúcar. As cepas PJ69 e arg82Δ não diferiram com relação ao transporte de sacarose, entretanto a cepa selvagem mostrou maior atividade invertásica. A quantificação de ATP intracelular nas cepas PJ69 e arg82Δ crescidas em glicose mostrou que, na fase exponencial e na estacionária, a cepa arg82Δ contém seis vezes mais ATP que a cepa selvagem. Em sacarose, o conteúdo de ATP de arg82Δ também foi maior, sendo 1,1 e 1,5 vezes maior que a PJ69, nas fases exponencial e estacionária respectivamente. Em fermentação com alta concentração de glicose (15% p/v), as duas cepas produziram ao final do processo, concentrações similares de etanol, porém, a cepa arg82Δ levou o dobro do tempo da cepa PJ69 para atingir a mesma concentração de etanol.