PPBIOTEC - Programa de Pós-graduação em Biotecnologia
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Resultados da Pesquisa
Item Análise proteômica comparativa de amostras de Trypanosoma cruzi pertencentes aos genótipos TcII e TcVI, isoladas de pacientes com doença de Chagas crônica.(2017) Inácio, Luciana de Jesus; Borges, William de Castro; Lana, Marta de; Oliveira, Maykon Tavares de; Borges, William de Castro; Palmisano, Giuseppe; Veloso, Vanja MariaO Trypanosoma cruzi é um parasito da ordem Kinetoplastida, agente etiológico da doença de Chagas (DCh), uma enfermidade de evolução crônica progressiva que afeta os sistemas cardiovascular, gastrointestinal e nervoso do hospedeiro humano. Esse protozoário é um parasito intracelular obrigatório que apresenta quatro estágios evolutivos: formas epimastigotas e tripomastigotas metacíclicas no sistema digestivo do inseto vetor; formas amastigotas (intracelulares) e tripomastigotas sanguíneas que parasitam o hospedeiro mamífero. A espécie está subdividida em seis genótipos distintos ou discret typing units (DTUs), nomeados TcI a TcVI, e TcBat. Vários estudos foram conduzidos visando correlacionar a variabilidade genética do T. cruzi com sua biologia e as manifestações clínicas da DCh, e a proteômica representa uma abordagem interessante para estudar mudanças globais na expressão de proteínas entre os diferentes genótipos. O objetivo deste trabalho foi caracterizar alguns parâmetros biológicos por meio de ensaios in vitro e realizar a análise proteômica quantitativa de amostras de T. cruzi pertencentes aos genótipos TcII e TcVI isoladas de pacientes com doença de Chagas crônica, provenientes do Vale do Jequitinhonha, MG. Para este fim, cada amostra de T. cruzi foi cultivada em meio LIT para determinação da curva de crescimento ao longo de 20 dias. A taxa de metaciclogênese foi avaliada em meio Grace. Células “Vero” foram infectadas com tripomastigotas obtidas da diferenciação em meio Grace para avaliar as taxas de infectividade e de multiplicação intracelular de cada amostra nos tempos de 24, 48 e 72 horas de cultivo. Os proteomas das três amostras de epimastigotas de T. cruzi (1107 – TcII, 229 e 2119 – TcVI; em fase exponencial) foram analisados por nano-UHPLC-MS/MS. Para identificação, quantificação label free e comparação das proteínas, foi utilizado o software PEAKS, versão 8, e a categorização das proteínas foi realizada pelo software Blas2GO versão 4.1. Os resultados obtidos revelaram diferenças significativas entre os genótipos TcII e TcVI. A amostra do genótipo TcII apresentou maior área sob a curva na análise do crescimento em meio LIT, enquanto as taxas de metaciclogênese, infectividade e desenvolvimento intracelular foram maiores nas amostras do grupo genético TcVI. A análise proteômica shotgun permitiu a identificação de 3833 proteínas, dentre as quais 212 exibiram expressão diferencial. Dessas proteínas, a maioria encontrava-se com a expressão aumentada nos isolados do genótipo TcVI. Este trabalho permitiu apontar diferenças biológicas e metabólicas importantes entre os isolados investigados e a identificação de possíveis assinaturas proteicas dos genótipos TcII e TcVI.Item Influência da doença de Chagas na farmacocinética do Benznidazol no modelo cão.(2022) Bandeira, Lorena Cera; Carneiro, Cláudia Martins; Pinto, Leonardo Santos Ribeiro; Carneiro, Cláudia Martins; Pinto, Leonardo Santos Ribeiro; Diniz, Andrea; Moreira, Fernanda de Lima; Veloso, Vanja Maria; Jeremias, Wander de JesusA alta variabilidade na eficácia e na segurança da quimioterapia anti-chagásica envolvendo o benznidazol (BNZ) pode ser devido às alterações farmacocinéticas. Tais alterações podem ser ocasionadas pela inibição de enzimas de metabolismo e transportadores de membranas devido ao aumento de mediadores do processo inflamatório na doença de Chagas. O presente estudo avaliou o impacto das infecções experimentais aguda e crônica pela cepa Be-78 do T. cruzi na farmacocinética do BNZ no modelo cão. Foram investigados 19 cães (n= 10 cães com infecção aguda; n= 9 cães com infecção crônica), SRD, com idade entre 04-10 meses e peso entre 20-35 kg. Os cães de ambas as fases da infecção foram divididos em dois grupos, sendo o Grupo I (infectado não tratado) e Grupo II (infectado e tratado). O estudo foi divido em 4 ocasiões. Na Ocasião 1 (antes da infecção) foi realizada coleta de sangue para análise de perfil das citocinas IL-6, IFN-γ, IL-10 e TNF-α por meio de ensaio de ELISA. Na Ocasião 2 (após a infecção, antes do início do tratamento) foi coletado sangue para análise de citocinas e carga parasitária por meio de qPCR. Na Ocasião 3 (após 10, 30, 40 e 60 dias de dose múltipla oral 3,5mg/Kg/12h de BNZ) foi realizada coleta seriada de sangue no intervalo de dose de 12h para análise farmacocinética para o Grupo II; e coleta de sangue para análise de citocinas e carga parasitária para os Grupos I e II. Na Ocasião 4 (após 30 dias do término do tratamento) foi coletado sangue para análise de citocinas e carga parasitária. O BNZ nas amostras de soro foi quantificado por CLAE-DAD. O método bioanalítico validado seguindo o guia da ANVISA, apresentou ausência de efeitos matriz e residual; limites de quantificação, estabilidade, precisão e exatidão compatíveis para a análise do BNZ em soro. Os parâmetros farmacocinéticos do BNZ, obtidos a partir de um modelo não compartimental, foram similares entre os momentos de coleta seriada na Ocasião 3 na fase aguda e também na fase crônica da infecção. O perfil farmacocinético do BNZ obtido em cães na fase aguda da doença é semelhante ao observado em cães sadios (dados históricos do nosso grupo de pesquisa). Por outro lado, foi observado que a infecção crônica aumenta os valores de Cmax (9,70 vs 17,97), Css (7,70 vs 12,56) e AUC0-12 (90,39 vs 150,76), e ainda reduz Vdss (17,34 vs 9,20) e CLss (0,84 vs 0,56) quando comparados com o grupo de cães sadios. Em relação a fase aguda, a fase crônica também eleva os valores de Cmax (10,55 vs 17,97), Css (7,08 vs 12,56), Cmin (4,32 vs 8,25) e AUC0-12 (84,98 vs 150,76) e reduz Vdss (13,92 vs 9,20) e CLss (0,99 vs 0,56). Os mediadores inflamatórios IFN-γ, IL-10, TNF-α e IL-6 estão aumentados nas fases aguda e crônica da doença, sendo a IL-6 a citocina produzida em maior quantidade e a única com aumento significativo (em até 7 vezes) de suas concentrações séricas nos cães da fase crônica em relação à fase aguda, mesmo quando o tratamento com o BNZ é administrado. Nos grupos I e II da fase aguda é observada uma elevada carga parasitária na Ocasião 2 que é reduzida significativamente nas Ocasiões 3 e 4. Nos grupos I e II da fase crônica observa-se uma baixa carga parasitária nas Ocasiões 2 e 3, e um aumento significativo da carga parasitária na Ocasião 4. Portanto, a infecção crônica experimental pela cepa Berenice-78 do T. cruzi altera significativamente a farmacocinética do BNZ em cães, provavelmente pela inibição do transporte de membrana glicoproteína-P (P-gp) causada pelo aumento da citocina pró-inflamatória IL-6.