PPBIOTEC - Programa de Pós-graduação em Biotecnologia
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Resultados da Pesquisa
Item Estudos sobre consumo de glicerol por leveduras para fins biotecnológicos.(2019) Cunha, Aureliano Claret da; Brandão, Rogélio Lopes; Santos, Fernanda Godoy; Lucas, Cândida Manuel Ribeiro Simões; Brandão, Rogélio Lopes; Tótola, Marcos Rogério; Freitas, Renata Nascimento de; Silva, Silvana de Queiroz; Mendes, Tiago Antônio de OliveiraNos últimos anos o aumento do excedente de produção do glicerol bruto, um subproduto da produção do biodiesel, tem estimulado a busca por processos alternativos de aplicação do glicerol. De entre as alternativas, destacam-se os processos biotecnológicos onde o glicerol é convertido por microrganismos em um produto com maior valor agregado, de amplo uso industrial e com menor impacto ambiental. O objetivo do presente trabalho foi caracterizar Wickerhamomyces anomalus LBCM1105, uma cepa capaz de utilizar eficientemente o glicerol como única fonte de carbono, através do isolamento e caracterização do transportador de alta afinidade de glicerol (WaStl1p), e do sequenciamento do seu genoma. Estratégias de engenharia genética foram também utilizadas em Saccharomyces cerevisiae BY4741, com intuito de otimizar o consumo de glicerol e obter a sua conversão em etanol. LBCM1105 apresentou velocidades de crescimento maiores que BY4741 independente do meio (YP ou YNB) e da fonte de carbono (glicose ou glicerol). Com o objetivo de melhorar o desempenho de BY4741 em glicerol, foi tentada a sobrexpressão simultânea do transportador ativo de glicerol Stl1 e da primeira enzima da assimilação do glicerol, a glicerol quinase Gut1, com vista a aumentar o fluxo metabólico de consumo do glicerol. Adicionalmente foi também sobrexpresso o fator de transcrição/ativador Pdc2 que controla vários genes, incluindo PDC1, PDC10 e THI10, com vista a promover o desvio do fluxo glicolítico para a fermentação. Todas as construções foram confirmadas por amplificação de fragmentos alvo e sequenciamento de DNA. O desempenho final de cada mutante foi avaliado, não tendo sido obtido o efeito esperado. A taxa de crescimento foi tanto menor quanto mais modificações genéticas, sugerindo uma diminuição de fitness proporcional. Em colaboração com o Laboratório Nacional de Ciência e Tecnologia do Bioetanol (CTBE), o genoma da LBCM1105 foi sequenciado, montado, anotado e submetido a análises filogenéticas multiloci. O genoma da W. anomalus LBCM1105 apresenta 12,78 Mb, com %CG de 34,52, cobertura de 20,5x em profundidade e 90% de extensão e completude. Comparando com leveduras conhecidas, o genoma contém todas as sequências de proteínas relacionadas ao transporte e metabolismo de glicerol. O gene WaSTL1 foi isolado por PCR e clonado no vetor (pCev-G2-Km). O mutante S. cerevisiae BY4741 stl1Δ foi transformado com a construção. A caracterização do mecanismo de transporte de glicerol confirmou (i) que WaStl1p tem uma elevada afinidade para o glicerol, Km = 0,96 ± 0,15 mM, (ii) que a cepa LBCM1105 apresenta além da afinidade uma elevada quantidade de transportador ativo, Vmax = 148,3 ± 10,16 μmol·h−1·g−1, e (iii) que o gene expresso heterologamente em S. cerevisiae stl1Δ complementa o mutante. O caráter ativo do transporte foi confirmado pela sensibilidade ao protonionóforo carbonil cianeto m-clorofenilhidrazona, tanto na LBCM1105 como na S. cerevisiae stl1Δ WaSTL1. Futuros estudos das vias metabólicas de glicerol em leveduras serão necessários para que novas estratégias de engenharia genética sejam mais eficientes.Item Análises genômicas para otimização da produção de compostos aromatizantes por estirpe de Saccharomyces cerevisiae isolada de produção de cachaça.(2018) Araújo, Thalita Macedo; Brandão, Rogélio Lopes; Diniz, Raphael Hermano Santos; Mendes, Tiago Antônio de Oliveira; Borges, William de Castro; Fietto, Luciano Gomes; Brandão, Rogélio Lopes; Andrade, Milton Hércules Guerra deA qualidade das bebidas alcoólicas está intimamente relacionada à presença de concentrações equilibradas de compostos voláteis, subprodutos do processo de fermentação alcoólica e altamente influenciados pela linhagem da levedura utilizada de tal modo que a compreensão das bases moleculares da produção de compostos desejáveis represente a possibilidade do incremento da qualidade de bebidas fermentadas visando a agregação de valor ao produto final. O presente trabalho tem como objetivo realizar uma análise de características genéticas e fisiológicas das leveduras isoladas da produção de cachaça com potencial para aplicação na produção de outras bebidas alcoólicas. Desse modo, 118 linhagens da coleção LBCM foram avaliadas quanto a capacidade de metabolização de maltose, produção de baixas concentrações de sulfeto de hidrogênio, capacidade de transporte de maltotriose e capacidade de produção de compostos voláteis. A despeito de sua origem comum, as leveduras avaliadas apresentaram diferenças significativas em sua fisiologia. Algumas dessas leveduras apresentam potencial biológico para aplicação na produção de outras bebidas, como, por exemplo, cerveja. A linhagem LBCM1073 foi selecionada dentre as demais por ser heterotálica e pela sua capacidade de produção de acetato de isoamila, um éster altamente desejável em diversas bebidas alcoólicas. Após sequenciamento genômico dessa levedura, com cobertura de 263 vezes e a predição de 5686 genes, análises de genômica comparativa revelaram que a linhagem LBCM1073 apresenta um conjunto de 24 genes ausentes na linhagem laboratorial S. cerevisiae S288c. Alguns desses genes apresentam similaridade com S. bayanus e Lachancea sp. Um total de 64,15% dos genes da linhagem LBCM1073 apresenta ortólogos com genes de 40 ascomicetos avaliados. Dentre as vias já mencionadas na literatura como relacionadas à produção de compostos voláteis, a via de sinalização mTOR e a glicólise, são as que apresentaram maior percentual de genes ortólogos, justificado pela ampla distribuição dessas duas vias dentre os organismos utilizados para análise. Ao serem comparadas as sequências de aminoácidos de 34 enzimas,relacionadas à produção de compostos responsáveis por aromas, 13 foram idênticas entre LBCM1073 e S. cerevisiae S288c. Para as demais, as proteínas codificadas por LEU4, PMA1, RSP5, TOR1 e FAS2 não apresentaram as substituições descritas na literatura como relacionadas à maior produção de compostos on flavour. Em conjunto, esses dados mostram que LBCM1073 e S. cerevisiae S288c apresentam diversas distinções a nível genômico. Uma metodologia capaz de contribuir para melhor elucidar essas diferenças em relação à produção de compostos secundários à fermentação é a técnica de BSA (Bulked Segregants Analisys) ou análise de agrupamentos de segregantes. As análises fenotípicas de segregantes obtidos do cruzamento entre LBCM1073 e S. cerevisiae S288c revelou uma discreta relação direta entre a capacidade de conversão de álcool isoamílico em acetato de isoamila e o crescimento na presença de TFL 0,5 mM. Além disso, os segregantes já obtidos e avaliados poderão ser empregados na análise de QTLs envolvidos na produção de acetato de isoamila.Item Caracterização bioquímico-molecular de cepas de Saccharomyces cerevisiae isoladas de dornas de fermentação de cachaça para produção de cervejas.(Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós Graduação, Universidade Federal de Ouro Preto., 2013) Araújo, Thalita Macedo; Brandão, Rogélio LopesA cerveja é uma bebida alcoólica produto da fermentação do malte de cevada por leveduras que vem sendo produzida desde, aproximadamente, 6000 anos a.C. Além de gás carbônico e etanol, as leveduras produzem durante a fermentação, compostos secundários que são responsáveis pela formação do flavour e consequente qualidade sensorial da bebida. Por isso o uso de leveduras selecionadas tem sido um aspecto de grande importância na obtenção de bebidas. Na fabricação da cerveja, podem ser utilizadas leveduras do tipo ale ou lager, que pertencem à espécie Saccharomyces cerevisiae e Saccharomyces pastorianus, respectivamente. Estas espécies podem ser classificadas tanto por testes bioquímicos quanto por seu comportamento diferencial durante a fermentação. O Laboratório de Biologia Celular e Molecular (LBCM) do Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas (NUPEB) da UFOP conta com uma coleção de cepas de Saccharomyces cerevisiae isoladas a partir de dornas de fermentação de cachaça, as quais foram selecionadas por sua alta capacidade de produção de compostos voláteis e alta resistência a diferentes tipos de estresse. O presente trabalho objetivou a caracterização bioquímica e molecular de 21 cepas da coleção LBCM e a utilização de critérios de seleção visando à aplicação destas cepas à produção de cervejas. Das 21 cepas estudadas, 11 foram capazes de fermentar maltose, apresentando velocidade específica de crescimento semelhante em meio contendo glicose. A identificação molecular das cepas através da região ITS-5.8S do rDNA confirmou que 10 cepas pertencem à espécie S. cerevisiae. Dois grupos de testes foram aplicados posteriormente sobre as 10 cepas selecionadas e 4 cepas cervejeiras comerciais. O primeiro grupo de testes incluiu critérios de seleção baseados na classificação ale e lager, no perfil de floculação e na capacidade de crescer sob baixas temperaturas. O segundo grupo, incluiu testes complementares baseados na tolerância ao etanol, na produção de sulfeto de hidrogênio (H2S) e 4-vinilguaiacol (4-VG), no transporte de α-glicosídeos e na síntese de micocinas. Os resultados mostraram que três das 10 cepas estudadas foram capazes de fermentar melobiose e secretar melobiase, perfil característico de cepas tipo lager, embora todas as cepas tenham crescido a 37°C. Além disso, 9 foram capazes de crescer a 20°C e 7 a 15°C. Quanto ao perfil de floculação, 9 cepas apresentaram percentuais de floculação maior que 36% e responderam com um fenótipo New-Flo. A presença dos genes FLO1, FLO5 e FLO11 foi verificada por PCR e quantificada por qPCR, sendo relevante a presença dos genes FLO5 e FLO11 na maioria das cepas. Em geral, as cepas mais floculantes foram também as que apresentaram maior hidrofobicidade na sua superfície celular. Quanto aos testes complementares, as cepas apresentaram resistência a altas concentrações de etanol (20% (v/v)), baixa ou nenhuma produção de H2S (off flavour) e síntese de 4-VG em concentrações semelhantes às apresentadas pelas cepas comerciais tipo ale. Considerando a importância do consumo total dos açúcares presentes no mosto, em especial a maltotriose, o transporte de α-glicosídeos foi avaliado. As cepas apresentaram um transporte de α-glicosídeos semelhante aos valores revelados pelas cepas cervejeiras comerciais. Finalmente, as cepas foram submetidas a testes de produção e resistência a micocinas, considerando o uso de fermentações consorciadas. Os resultados revelaram que todas as cepas experimentais não são sensíveis, tampouco prejudiciais a outras espécies. Com base nos resultados dos testes complementares, foram selecionadas as cepas experimentais LBCM 45 e 78 para a produção de cervejas german pilsner e weissbier, respectivamente. As cervejas produzidas foram submetidas a análises físico-químicas, cujos resultados mostraram que as cepas em estudo, LBCM 45 e 78 apresentaram comportamento semelhante às cepas cervejeiras comerciais W-34/70 e WB-06. Portanto, os resultados do presente trabalho contribuíram para uma melhor caracterização da grande diversidade de linhagens de S. cerevisiae isoladas da produção de cachaça, visando sua potencial utilização na produção de outras bebidas alcoólicas fermentadas, tais como as cervejas, além da sua possível utilização em fermentações consorciadas.