PPBIOTEC - Programa de Pós-graduação em Biotecnologia
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Resultados da Pesquisa
Item Avaliação da produção de bio-hidrogênio e da expressão do gene glpfF durante a fermentação de glicerol por Enterobacter sp.(2018) Souza, Isabela Morato de; Silva, Silvana de Queiroz; Silva, Silvana de Queiroz; Santos, Alexandre Soares dos; Moreira, Patrícia de AbreuDevido ao aumento da demanda energética mundial a busca por fontes renováveis de energia tem ganhado espaço nos últimos anos. Com isso, a produção de biodiesel tem expandido significativamente tendo como consequência o aumento da oferta de glicerol bruto. Encontrar funcionalidade para este co-produto da produção do biodiesel passou a ser uma questão frequente e oportuna para a pesquisa, uma vez que esta não pode ser descartado sem pré-tratamento e apresenta inúmeras aplicações na indústria. A fermentação escura realizada por bactérias pode se aliar ao tratamento do glicerol uma vez que sua conversão resulta na obtenção de diversos compostos de valor agregado, bem como o bio-hidrogênio. Desta maneira o presente estudo objetivou avaliar o processo de produção de hidrogênio por Enterobacter sp. 9R a partir do glicerol. O sequenciamento do genoma desta bactéria foi realizado e os genes envolvidos na produção de hidrogênio foram identificados e comparados entre diferentes espécies. Ensaios com diferentes concentrações de glicerol inicial (5 g/L, 20 g/L e 40 g/L) foram conduzidos e os produtos de fermentação e expressão do gene glpF (facilitador de glicerol) foram monitorados. Para os ensaios de fermentação com 5 g/L e 20 g/L de glicerol o isolado consumiu todo o substrato e obteve rendimentos de 0,41 e 0,35 mmol H2/mmol de glicerol, respectivamente. Na condição de 20 g/L observou-se a maior produção de hidrogênio e de seu subproduto etanol, com valores de 12,18 mmol de H2 e 6,53 g/L de etanol. Para a condição com maior concentração de glicerol, o substrato foi consumido em apenas 44,04% e apresentou uma consequente queda nos rendimentos dos produtos de interesse. Tal fato se deve ao direcionamento do fluxo de carbono para vias independentes da produção de hidrogênio ocorrendo um fenômeno de inibição conjunta no consumo de substrato e produção de H2. Em relação à expressão do gene glpF esta foi considerável na condição de 5 g/L, sendo 7 vezes maior do que na concentração de 40 g/L de glicerol. Demonstrando assim, que em baixas concentrações o glicerol é internalizado pelo seu transportador. E em altas concentrações o substrato é conduzido para o meio intracelular por difusão, trazendo desvantagens ao consumo e consequente conversão do glicerol, comprometendo o rendimento de produtos da fermentação.Item Estudos sobre consumo de glicerol por leveduras para fins biotecnológicos.(2019) Cunha, Aureliano Claret da; Brandão, Rogélio Lopes; Santos, Fernanda Godoy; Lucas, Cândida Manuel Ribeiro Simões; Brandão, Rogélio Lopes; Tótola, Marcos Rogério; Freitas, Renata Nascimento de; Silva, Silvana de Queiroz; Mendes, Tiago Antônio de OliveiraNos últimos anos o aumento do excedente de produção do glicerol bruto, um subproduto da produção do biodiesel, tem estimulado a busca por processos alternativos de aplicação do glicerol. De entre as alternativas, destacam-se os processos biotecnológicos onde o glicerol é convertido por microrganismos em um produto com maior valor agregado, de amplo uso industrial e com menor impacto ambiental. O objetivo do presente trabalho foi caracterizar Wickerhamomyces anomalus LBCM1105, uma cepa capaz de utilizar eficientemente o glicerol como única fonte de carbono, através do isolamento e caracterização do transportador de alta afinidade de glicerol (WaStl1p), e do sequenciamento do seu genoma. Estratégias de engenharia genética foram também utilizadas em Saccharomyces cerevisiae BY4741, com intuito de otimizar o consumo de glicerol e obter a sua conversão em etanol. LBCM1105 apresentou velocidades de crescimento maiores que BY4741 independente do meio (YP ou YNB) e da fonte de carbono (glicose ou glicerol). Com o objetivo de melhorar o desempenho de BY4741 em glicerol, foi tentada a sobrexpressão simultânea do transportador ativo de glicerol Stl1 e da primeira enzima da assimilação do glicerol, a glicerol quinase Gut1, com vista a aumentar o fluxo metabólico de consumo do glicerol. Adicionalmente foi também sobrexpresso o fator de transcrição/ativador Pdc2 que controla vários genes, incluindo PDC1, PDC10 e THI10, com vista a promover o desvio do fluxo glicolítico para a fermentação. Todas as construções foram confirmadas por amplificação de fragmentos alvo e sequenciamento de DNA. O desempenho final de cada mutante foi avaliado, não tendo sido obtido o efeito esperado. A taxa de crescimento foi tanto menor quanto mais modificações genéticas, sugerindo uma diminuição de fitness proporcional. Em colaboração com o Laboratório Nacional de Ciência e Tecnologia do Bioetanol (CTBE), o genoma da LBCM1105 foi sequenciado, montado, anotado e submetido a análises filogenéticas multiloci. O genoma da W. anomalus LBCM1105 apresenta 12,78 Mb, com %CG de 34,52, cobertura de 20,5x em profundidade e 90% de extensão e completude. Comparando com leveduras conhecidas, o genoma contém todas as sequências de proteínas relacionadas ao transporte e metabolismo de glicerol. O gene WaSTL1 foi isolado por PCR e clonado no vetor (pCev-G2-Km). O mutante S. cerevisiae BY4741 stl1Δ foi transformado com a construção. A caracterização do mecanismo de transporte de glicerol confirmou (i) que WaStl1p tem uma elevada afinidade para o glicerol, Km = 0,96 ± 0,15 mM, (ii) que a cepa LBCM1105 apresenta além da afinidade uma elevada quantidade de transportador ativo, Vmax = 148,3 ± 10,16 μmol·h−1·g−1, e (iii) que o gene expresso heterologamente em S. cerevisiae stl1Δ complementa o mutante. O caráter ativo do transporte foi confirmado pela sensibilidade ao protonionóforo carbonil cianeto m-clorofenilhidrazona, tanto na LBCM1105 como na S. cerevisiae stl1Δ WaSTL1. Futuros estudos das vias metabólicas de glicerol em leveduras serão necessários para que novas estratégias de engenharia genética sejam mais eficientes.Item Bioprospecção de leveduras oleaginosas capazes de utilizar o glicerol bruto como fonte de carbono.(2015) Siqueira, Filipe da Silva; Brandão, Rogélio LopesOs biocombustíveis, bioetanol e biodiesel, estão entre as fontes de energia alternativas promissoras para reduzir a utilização dos combustíveis fósseis. O biodiesel é um éster metílico ou etílico obtido a partir da transesterificação de óleos vegetais na presença de um álcool. Esta reação gera como subproduto, o glicerol bruto (GB), que equivale a 10% de todo volume gerado. Uma alternativa para o consumo do GB é a sua utilização como fonte de carbono por micro-organismos oleaginosos. Os óleos estocados podem ser utilizados como uma fonte alternativa de óleos para produção do biodiesel. Os micro-organismos oleaginosos são capazes de acumular mais de 20% de sua biomassa em lipídeos e seus óleos apresentam estrutura química semelhante aos óleos vegetais. Portanto, o objetivo deste trabalho foi selecionar leveduras capazes de metabolizar o glicerol bruto e estocá-lo na forma de lipídeos. Sessenta e três isolados de leveduras oriundas da produção de cachaça foram avaliados quanto à capacidade de crescer na presença de GB, como única fonte de carbono, e armazená-lo na forma de lipídeos. As leveduras foram inoculadas em meio mínimo Synthetic Defined (SD) contendo 10% de GB e incubadas a 23°C, durante um período de 48 horas. No ensaio colorimétrico com Sudan Black (corante lipofílico) as culturas foram fixadas em lâminas e analisadas em microscópio óptico. Vinte e cinco cepas foram selecionadas como leveduras capazes de armazenar lipídeos. Posteriormente, estas cepas foram submetidas a ensaio quantitativo utilizando o corante fluorescente Nile Red. Para isso, foram inoculadas em meio SD com 10% de GB, incubadas a 28°C, sob agitação de 180 RPM, por 48 horas e colocadas em solução Nile Red 0,1 mg/mL por 10 minutos. Seis leveduras apresentaram o dobro da acumulação de lipídeo em comparação a Yarrowia lipolytica (controle positivo). Estas cepas foram posteriormente submetidas à caracterização dos ácidos graxos produzidos, na cromatografia gasosa-Flame Ionization Detector (CG-FID). A cepa LBCM3 apresentou o maior conteúdo lipídico dentre as selecionadas com 36,60% de lipídeos. Além disso, esta foi a única cepa capaz de produzir simultaneamente os ácidos linoléico e linolênico, lipídeos estes importantes para produção de biodiesel. A cepa LBCM17 apresentou o segundo maior conteúdo lipídico com 27,90% de lipídeos totais. As cepas LBCM95 e LBCM98 exibiram 21,90% e 2,17% de lipídeos totais, respectivamente. A LBCM1 apresentou o menor conteúdo lipidíco com 0,22% de lipídeos totais. Os resultados demonstram que as leveduras selecionadas são capazes de utilizar o GB como fonte de carbono e possuem potencial para aplicação na produção de biodiesel. As seis leveduras selecionadas na análise semi-quantitativa, segundo resultado do sequenciamento da região ITS5.8s, são Saccharomyces cerevisiae.Item Tratamento do glicerol bruto proveniente da produção de biodiesel visando a geração de metano.(2014) Albuquerque, Mariana Furtado Granato de; Silva, Silvana de QueirozTradicionalmente, o tratamento de efluentes com alto teor de matéria orgânica é realizado através da técnica de digestão anaeróbia, que por sua vez é capaz de transformar a matéria orgânica complexa em gases com alto poder calorífico, como o hidrogênio e o metano. O objetivo deste estudo foi avaliar o desempenho de reatores UASB no tratamento do glicerol bruto derivado da produção de biodiesel em diferentes condições de concentração de DQO inicial, temperatura e TDH, principalmente no que tange à remoção de DQO, produção de metano e acúmulo de AGV. Além disso, comparou-se a degradação anaeróbia do glicerol bruto com a da glicerina pura. Quatro reatores UASB foram operados em 2 fases: na primeira, foram testados dois substratos diferentes sob temperaturas diferentes, carga orgânica de 1 g DQO.L-1.d-1 e TDH de 24 horas. Na Fase 2, a carga orgânica foi dobrada e sua influência na degradação do glicerol bruto em diferentes temperaturas foi avaliada. Os principais resultados do estudo podem ser resumidos como a seguir: i) O glicerol bruto demonstrou não ser tóxico à biomassa anaeróbia e possuir boa capacidade de produção a metano (AME = 0,51 gDQOmetano/gSSV.d e PM = 0,96 gDQOCH4/gDQOincubada); ii) Elevadas eficiências medianas de degradação (77-84% de remoção de DQO) foram acompanhadas por pequeno acúmulo de AGV( 112–170 mg DQOAGV/L) na Fase 1 após um longo período de adaptação dos microrganismos, sem diferença significativa entre os reatores alimentados com glicerina pura e àqueles alimentados com glicerol bruto; iii) Uma maior carga orgânica (2 g DQO.L-1.d-1) prejudicou a remoção de matéria orgânica (21-48% de eficiência) e aumentou o acúmulo de AGV (272-563 mg DQOAGV/L); iv) A baixa produção de metano na Fase 1, em comparação com a Fase 2, indica que a quantificação deste gás foi subestimada. Portanto, pode-se inferir que o efluente da produção de biodiesel pode ser utilizado na produção de metano, mas a eficiência do processo é fortemente dependente e sensível à carga orgânica. Dessa forma, este estudo contribui fortemente para o avanço do conhecimento nas áreas de degradação anaeróbia do glicerol bruto e implantação desta técnica nas indústrias de biodiesel.