PPBIOTEC - Programa de Pós-graduação em Biotecnologia
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Item Avaliação de RNAs não codificadores longos específicos de Schistosoma mansoni, como candidatos a biomarcadores da esquistossomose murina.(2021) Rocha, Flávia Arêdes; Cota, Renata Guerra de Sá; Cota, Renata Guerra de Sá; Cabral, Fernanda Janku; Silva, Glenda Nicioli daRNAs não codificantes longos (lncRNAs) possuem um importante papel na regulação transcricional e pós-transcricional. São classificados como transcritos maiores que 200 nucleotídeos, que não apresentam potencial de codificar proteínas, sendo observados tanto no núcleo como no citoplasma. Estudos recentes vêm demonstrado que, dependendo de sua localização e de suas interações específicas com DNA, RNA e proteínas, os lncRNAs podem modular a função da cromatina, alterar a estabilidade e a tradução de mRNAs citoplasmáticos e interferir nas vias de sinalização. Muitas dessas funções, em última análise, afetam a expressão gênica em diversos contextos biológicos e muito provavelmente estão relacionados aos mecanismos referentes à interação parasito-hospedeiro. Por outro lado, os padrões de expressão estágio-específico sugerem que os lncRNAs são biomarcadores em potencial para a detecção da esquistosomose, uma parasitose debilitante e de grande impacto socioeconômico no mundo, causada por platelmintos do gênero Schistosoma. Acredita-se que a complexidade dos programas de diferenciação e desenvolvimento observado entre os diferentes estágios evolutivos e ambientes onde o parasita vive seja dependente da regulação da expressão gênica, e neste cenário os lncRNAs seriam moléculas chave. As hipóteses desse trabalho são que o S. mansoni expressa um conjunto de lncRNAs de forma diferencial através da reprogramação de sua expressão gênica em determinados estágios evolutivos, e que esses lncRNAs são importantes na interação parasito-hospedeiro. Recentemente, nosso grupo de pesquisa identificou um conjunto de 170 novos lncRNAs em S. mansoni e deste conjunto, quinze mostraram expressão diferencial quando comparado os estágios larvais e adultos do verme, bem como entre machos e fêmeas. Continuando essa linha de investigação, o objetivo desse trabalho foi avaliar a expressão de 47 lncRNAs nos estágios de cercárias, esquistossômulos com 3,5h de cultivo in vitro, vermes adultos e ovos, bem como em amostras de fígado e sangue de camundongos BALB/c infectados e não infectados com S. mansoni. Do conjunto de 47 lncRNAs avaliados, 29 foram considerados como expressos em vermes adultos, utilizando a técnica de qRT-PCR. A seguir, este conjunto se mostrou diferencialmente expresso entre os estágios evolutivos avaliados. Posteriormente foram realizados testes qualitativos e quantitivos utilizando fígado e sangue de camundongos infectados e não infectados, apresentando detecção de lncRNAs específicos de S. mansoni no hospedeiro mamífero. Em conjunto, podemos concluir que os lncRNAs são diferencialmente expressões em S. mansoni e com potencial de biomarcador.Item Proteômica quantitativa baseada em espectrometria de massas para estudo do trato alimentar de Schistosoma mansoni com ênfase na glândula esofagiana e suas secreções.(2018) Neves, Leandro Xavier; Borges, William de Castro; Wilson, R. Alan; Borges, William de Castro; Palmisano, Giuseppe; Castro, Ieso de Miranda; Cota, Renata Guerra de Sá; Marco, Ricardo deA esquistossomose é uma doença tropical negligenciada que afeta mais de 240 milhões de pessoas em 78 países. Apesar dos esforços para erradicação da doença, fatores como baixa cobertura dos programas de tratamento quimioterápico, métodos diagnóstico pouco sensíveis e reinfecções em regiões endêmicas, constituem desafios para o controle da transmissão. O desenvolvimento de vacinas contra schistosomas constitui uma ferramenta alternativa de combate à doença, porém, a identificação de antígenos protetores tem sido um grande desafio. Neste sentido, destaca-se o modelo de auto cura da infecção em macaco Rhesus (Macaca mulatta), no qual observa-se eliminação de parasitos após uma resposta humoral direcionada às interfaces do parasito, como tegumento e secreções da glândula esofagiana. Neste contexto, o presente trabalho teve como objetivo geral a caracterização proteômica em larga escala de produtos da glândula esofagiana e demais secreções do trato alimentar de S. mansoni para proposição de novos alvos vacinais. Uma abordagem quantitativa avaliou a presença de proteínas de interface em homogenato solúvel de vermes adultos, revelando uma baixa representatividade de moléculas de interesse nessa fração. A partir disso, um método de enriquecimento tecidual foi utilizado para a análise detalhada do esôfago de vermes machos adultos. As análises shotgun quantitativas apontaram 628 grupos de proteínas enriquecidos na região esofagiana, incluindo Microexon genes (MEG), hidrolases, glicosil transferases e proteínas para transporte vesicular. Ademais, essa abordagem permitiu a detecção de proteoformas de MEGs geradas por substituição e/ou deleção de resíduos de aminoácidos. Nove proteínas expressas na glândula esofagiana foram selecionadas para quantificação absoluta por QconCAT. A MEG-12 apresentou a maior concentração entre os alvos quantificados. A estimativa do número de cópias por célula das proteínas secretadas sugere que tais moléculas constituem alvos abundantes neste subproteoma. Por último, a caracterização proteômica do sobrenadante de cultura de S. mansoni resultou na detecção de um repertório expandido de proteínas do trato alimentar, incluindo MEGs esofagianas, reforçando a eventual exposição das secreções nessa interface parasito-hospedeiro. Em conjunto, as abordagens proteômicas de caracterização da região esofagiana e trato alimentar de S. mansoni resultaram na identificação de moléculas com potencial aplicação biotecnológica no desenvolvimento de vacinas, bem como alvos terapêuticos.Item Caracterização de genes talin e os efeitos do silenciamento por RNAi usando miR-190 em Schistosoma mansoni.(2019) Paiva, Thales Henrique de; Cota, Renata Guerra de Sá; Cota, Renata Guerra de Sá; Jeremias, Wander de Jesus; Borges, William de CastroA esquistossomose é uma doença parasitária de grande importância econômica e social afetando aproximadamente 200mi/ano de pessoas no mundo. Causada pelo nematódeo do gênero Schistosoma (especificamente neste estudo o S. mansoni por ser o de maior prevalência no Brasil), continua sendo um desafio para a comunidade científica sua compreensão ampla e descoberta de novas tecnologias diagnósticas e terapêuticas. Este estudo realizado trata da caracterização in vitro e in silico da proteína talin bem como avaliar os efeitos ultraestruturais após silenciamento in vitro por seu microRNA intrônico miR-190 em vermes adultos. As proteínas Talinas são uma família de proteínas grandes adaptadoras que conectam uma família de moléculas de adesão celular chamadas integrinas aos filamentos de F-actina do citoesqueleto. Há dois tipos de genes Talin em vertebrados. Talin 1 é essencial para o processo de adesão celular mediado por integrinas enquanto o papel do Talin 2 é desconhecido. Duas entradas da proteína talina previamente anotadas no genoma do S. mansoni, identificadas como Smp_167010 e Smp_142630 foram objeto desse estudo. Análises de predição estrutural in silico foram feitas e observado um padrão diferencial de domínios funcionais (PFAM), bem como alto grau de similaridade e identidade com seus ortólogos (SWISS-MODEL) e os dados indicam que as duas entradas não são oriundas de splicing alternativo e sim de diferenciação e especiação com valores de bootstrap próximo ou atingindo 100 (filogenia). Amostras de vermes adultos machos e fêmeas, cercárias, esquistossômulos mecanicamente transformados (EMT3,5h – EMT-24h) e ovos de S. mansoni foram utilizados para traçar o perfil de expressão gênica por qRT-PCR usando o gene constitutivo EIF4E como controle endógeno. A expressão gênica relativa foi determinada pelo método 2 –ΔCq. A análise estatística foi realizada utilizando o teste one-way ANOVA (Tukey) com P<0,01. Foi observado um perfil de expressão gênica diferencial em Smp_167010 e Smp_142630 tanto entre as fases de vida do verme quanto entre os dois genes. Foi ainda observado alterações ultraestruturais significativas em vermes adultos machos expostos ao miR-190 em comparação ao controle com a presença de descamação, bolhas e fissuras enquanto nenhuma alteração em fêmeas foi identificado. Em conclusão vimos que o S. mansoni possui dois genes talin que indicam ter grande importância em sua biologia e que há retroregulação do gene talin por seu microRNA intrônico miR-190 que quando ofertado em meio livre interfere em processos biológicos e causa danos estruturais visíveis.Item RNAs não codificadores longos em Schistosoma mansoni : predição e perfil de expressão diferencial no estágio evolutivo de verme adulto.(2018) Oliveira, Victor Fernandes de; Cota, Renata Guerra de Sá; Cota, Renata Guerra de Sá; Freitas, Henrique Cota de; Moreira, Leandro Marcio; Gomes, Matheus de Souza; Borges, William de CastroA esquistossomose é considerada uma doença debilitante de grande impacto socioeconômico no mundo causada por platelmintos do gênero Schistosoma. Uma das principais espécies identificadas nesse gênero é o parasita Schistosoma mansoni, que apresenta um ciclo de vida bastante complexo. Acredita-se que a complexidade dos programas de diferenciação e desenvolvimento observado entre os diferentes estágios evolutivos e ambientes onde o parasita vive seja dependente da regulação da expressão gênica. Os RNAs não codificantes representam uma das principais classes de moléculas que potencialmente controlam a regulação gênica nos níveis: epigenético, transcricional, pós-transcricional e traducional. Esses RNAs são divididos em dois grandes grupos, os RNAs pequenos não codificantes de proteína e os RNAs longos não codificantes (lncRNAs), o foco desse projeto. Os lncRNAs correspondem aos transcritos com mais de 200 nucleotídeos e que não codificam proteínas. Particularmente, estão envolvidos em diversas funções regulatórias celulares, como regular a transcrição, induzir o remodelamento da cromatina e modificações em histonas, originar siRNAs endógenos, modular atividades de proteínas, alterar a localização celular de proteínas, ser precursores de pequenos RNAs, entre outros. A hipótese desse trabalho é que o S. mansoni expresse um conjunto de lncRNAs de forma diferencial através da reprogramação de sua expressão gênica em determinados estágios evolutivos. Para investigá-la foi utilizado um conjunto de dados de RNA-seq disponível para a fase adulta do parasito objetivando: (i) a montagem de um pipeline para identificar e caracterizar lncRNAs a partir de dados de RNA-seq com alta confiança; (ii) classificar os novos lncRNAs preditos utilizando a anotação Gene Ontology; (iii) analisar a expressão de um conjunto de 20 lncRNAs em cercária, esquistossômulos com 3,5h de cultivo in vitro, machos, fêmeas, casal e ovos; (iv) analisar a expressão de lncRNAs em parasitos resistentes ao praziquantel e (v) analisar a expressão de lncRNAs em fígado de camundongo infectado e não infectado com S. mansoni. Foram identificados 170 novos Sm-lncRNAs com termos de ontologia relacionados ao metabolismo, transporte e biossíntese. Quinze dos preditos lncRNAs mostraram expressão diferencial nos estágios avaliados, bem como entre machos e fêmeas. Alguns apresentaram expressão diferencial em parasitos com resistência ao praziquantel e em fígado de camundongos infectados. Esses achados abrem novas perspectivas para estudos funcionais focados em resistência a essa droga e desenvolvimento de biomarcadores específicos para a esquistossomose.Item Identificação e caracterização de microRNAs de origem intrônica em Schistosoma mansoni.(2013) Oliveira, Victor Fernandes de; Cota, Renata Guerra de SámicroRNAs (miRNAs) são uma classe de reguladores pós-transcricionais com aproximadamente 22 nucleotídeos. Estas moléculas regulam a expressão gênica por se ligarem a sequências complementares existentes na região 3’UTR de mRNAs específicos, induzindo sua degradação ou silenciamento. Utilizando abordagens computacionais, nosso grupo de pesquisa identificou 42 novos miRNAs precursores em Schistosoma mansoni, sendo que 5 destes, eram de origem intrônica. Considerando que cerca de metade dos miRNAs humanos conhecidos estão localizados em íntrons de genes codificantes de proteínas e que muitos deles são expressos somente quando o gene é transcrito, levantamos a hipótese de que parte do repertório de miRNAs de S. mansoni poderia ser de origem intrônica. Para investigar esta hipótese foi utilizada a versão 5.1 do genoma deste parasito, bem como analisada o perfil de expressão utilizando a metodologia de qRT-PCR nos seguintes estágios evolutivos do parasito: cercárias, esquistossômulos jovens (3,5 e 24h de cultivo in vitro), vermes adultos, ovos e miracídios. Após a recuperação do arquivo contendo as sequências de íntrons presentes nos genes de S. mansoni, foram recuperadas somente as que continham entre 50 a 120 nucleotídeos e que apresentavam o mínimo de energia livre de ΔG<-25 Kcal/mol, estimado pelo software RNAfold. Essas análises mostraram um conjunto de 38 candidatos a moléculas precursoras de miRNAs. Posteriormente utilizando a ferramenta Mature Bayes foram preditos os miRNAs maduros, e a seguir, utilizados para busca de homologia no o banco de dados miRBase. Os resultados mostraram que os miRNAs preditos não apresentam homólogos no mirBase, levantando a hipótese de que este conjunto seja específico da espécie S. mansoni. A análise do perfil de expressão mostrou que dos 38 miRNAs preditos, 19 apresentaram expressão em pelo menos um estágio evolutivo analisado. Não foram identificados miRNAs estágios específicos, apesar de todos serem diferencialmente expressos. Com relação ao perfil de expressão dos genes hospedeiros, também foi observado uma expressão diferencial entre os estágios analisados. Finalmente para a predição dos alvos, foi utilizado o programa miRanda, evidenciando um conjunto de 993 alvos potenciais, sugerindo que 10% dos genes preditos em S. mansoni poderiam ser regulados por miRNAs. Em conjunto os resultados sugerem que parte dos miRNAs de S. mansoni estão localizados em genes que codificam proteínas. Esta observação levanta uma série de questões interessantes que serão futuramente investigadasItem Alterações hepatoesplênicas associadas à infecção por Schistosoma mansoni no modelo murino.(2012) Campos, Jonatan Marques; Borges, William de CastroA Esquistossomose é uma doença endêmica em vários países, afligindo mais de 207 milhões de pessoas no mundo. É considerada a segunda infecção parasitária mais importante em termos de saúde pública devido ao impacto socio-econômico, podendo ocasionar cerca de 200 mil mortes anualmente. A caracterização do genoma e transcriptoma do Schistosoma mansoni propiciou o emprego de técnicas na área da proteômica as quais vem permitindo maior compreensão da biologia deste parasito em todos os estágios de seu ciclo de vida. Entretanto, até o momento, poucos estudos proteômicos abordaram a relação parasito-hospedeiro. O entendimento desta relação é de fundamental importância para a proposição de novos métodos de diagnóstico, avaliação de prognóstico e tratamento da doença. O presente trabalho teve como foco a análise das alterações no proteoma solúvel de fígado e baço, utilizando o modelo murino de infecção por S. mansoni. A primeira abordagem fundamentou-se na discriminação dos estágios de fase aguda e fase crônica nos animais infectados. Após realização do exame parasitológico de fezes, avaliação das alterações hepatoesplênicas através da relação (% órgão/corpo) e histologia de fígado e baço, foi possível estabelecer que o grupo de animais com 5 semanas de infecção desenvolveu a fase aguda da esquistossomose e animais infectados por 7 semanas apresentaram a fase crônica da doença. A técnica de eletroforese bidimensional comparativa, para proteínas solúveis de fígado e baço de animais controles e infectados, demonstrou alterações nos níveis de expressão de proteínas associadas com processos e vias bioquímicas diversas, como resposta ao estresse celular, tradução, ciclo da uréia e via glicolítica. No fígado, a categoria de proteínas chaperoninas apresentou maior número de representantes com alteração de expressão dentre as quais se destacam GRP-78 (proteína reguladora de glicose 78 kDa), HSP-71 (proteína de choque térmico 71 kDa), Erp-60 (calreticulina) e PDI (proteína dissulfeto isomerase). Por outro lado, proteínas como a CPSase I (carbamoil fosfato sintetase I), albumina, indoletilamina N-metiltransferase, peroxirredoxina-6 e anidrase carbônica III apresentaram expressão diminuída no fígado em decorrência da infecção. O perfil proteômico do fígado do animal infectado correlacionou-se com a análise histológica do órgão na qual se observa uma intensa resposta imune celular. No baço, as proteínas identificadas com alteração de expressão foram calreticulina, fosfoglicerato quinase I, frutose-bifosfato aldolase A, gliceraldeído 3 fosfato desidrogenase, EF-Tu, (fator de elongamento) e aspartato aminotransferase. Em geral, as proteínas diferencialmente presentes no baço de animais infectados apresentaram aumento de expressão, sendo o perfil molecular compatível com a demanda de produção de energia e síntese proteica. Estes dois processos são altamente relevantes para o custeio da intensa proliferação celular observada no órgão. Coletivamente, os resultados obtidos demonstraram que a abordagem proteômica empregada permitiu a identificação de marcadores teciduais induzidos pela infecção por S. mansoni. Abordagens futuras permitirão estabelecer se as alterações teciduais decorrentes da infecção pelo parasito alteram significativamente o proteoma plasmático a ponto de indicar novos biomarcadores da esquistossomose.Item Expressão de microRNAs em formas larvais e adultas de Schistosoma mansoni.(2014) Abreu, Fabiano Carlos Pinto de; Cota, Renata Guerra de SáA esquistossomose é uma doença debilitante causada por platelmintos do gênero Schistosoma. Devido ao seu ciclo de vida complexo, posição evolutiva e dimorfismo sexual, o parasita Schistosoma mansoni é um modelo interessante para investigar mecanismos de regulação da expressão gênica. MicroRNAs (miRNAs) são pequenas moléculas de RNA endógeno que regulam a expressão gênica em nível pós-transcricional pela interação específica a RNA mensageiros alvos. O conhecimento atual de miRNAs em S. mansoni é limitado e baseado em predições computacionais e sequenciamento de nova geração a partir de bibliotecas de vermes adultos. No presente estudo, nós caracterizamos os perfis de expressão de nove microRNAs maduros nas formas larvais e adultas do parasita usando qRT-PCR. Além disso, foram identificados os genes alvos desses miRNAs utilizando abordagens computacionais. Nossos resultados mostraram padrões de expressão diferenciais para os miRNAs: sma-miR-2162-3p, sma-miR-250, sma-miR-92a, sma-miR-new_2-5p, sma-miR-new_4-3p, sma-miR-new_4-5p, sma-miR-new_12-5p, sma-miR-new_13-5p e sma-miR-new-16-3p. A análise computacional revelou alvos de miRNAs envolvidos em processos celulares importantes como a via de sinalização TGF-β, metabolismo de glicose e lipídeos, proteína Tetraspanina (TSP), proteína Catepsina B1 (CB1) e proteína VAL-6 (“Venom-allergen-like 6 protein”). Além disso, grande parte dos genes preditos estão envolvidos com o processo de fosforilação oxidativa, sugerindo que pelo menos em parte a expressão dos genes que codificam para subunidades do complexo NADH desidrogenase, citocromo c oxidase e ATP sintase são regulados por miRNAs. Observamos também, seis alvos associados ao sistema ubiquitina-proteassoma, sugerindo que esses miRNAs possam regular esse importante processo biológico no parasita. Tomados em conjunto, podemos concluir que os miRNAs analisados são diferencialmente expressos e atuam fortemente como reguladores da expressão gênica em nível pós-transcricional.Item Síntese de peptídeos ricos em prolina e arginina e atividade inibitória sobre o complexo proteolítico proteassoma 20s de mamíferos e do parasito Schistosoma mansoni.(Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós Graduação, Universidade Federal de Ouro Preto., 2012) Breguez, Gustavo Silveira; Andrade, Milton Hércules Guerra deO proteassoma tem sido considerado um potencial alvo farmacológico devido ao seu envolvimento em processos vitais relacionados à proteólise celular, sendo a mais importante entre as vias de degradação. Recentemente, foi demonstrado que moléculas análogas ao peptídeo PR-11(RRRPRPPYLPR), que corresponde aos 11 primeiros aminoácidos da porção N-terminal do peptídeo PR-39, apresentam uma forte inibição sobre o proteassoma humano 20S, inibindo a atividade quimotripsina-símile em concentrações namolares (nM). Os peptídeos dessa classe desempenham importantes atividades anti-inflamatórias e angiogênicas. Novas moléculas envolvendo substituições conservativas de aminoácidos e sínteses de peptídeos cíclicos podem ser derivadas dessas estruturas, com o intuito de se encontrar melhores inibidores. Dessa forma, este trabalho teve como objetivos a síntese do peptídeo PR-11 e análogos para a realização de ensaios de atividade peptidásica in vitro, visando verificar o potencial inibitório dos peptídeos sintetizados em frações enriquecidas com proteassoma 20S de fígado de camundongos Swiss, eritrócitos humanos e vermes adultos de Schistosoma mansoni. Os peptídeos foram sintetizados empregando-se a estratégia Fmoc em fase sólida, purificados em sistema HPLC e identificados por espectrometria de massas. As frações com proteassoma 20S foram obtidas a partir de cromatografias de filtração molecular em Sephacryl S-400, as quais permitiram preparar satisfatoriamente enriquecidos de proteassoma livres de proteases de baixa massa molecular. Todos os análogos foram capazes de inibir a atividade quimotripsina-símile in vitro do proteassoma 20S das três espécies estudadas, utilizando a concentração final de 1μM de peptídeo. De um modo geral, as intensidades das atividades inibitórias foram similares para o proteassoma 20S de camundongos e humanos e menores para o de vermes adultos de Schistosoma mansoni. Os análogos cíclicos C8C15 e C9C15, quando comparados ao PR-11, apresentaram menor atividade sobre o proteassoma de humanos e atividade similar quanto à inibição em Schistosoma mansoni. Tal fato sugere que esse tipo de alteração estrutural possa ser útil na busca por inibidores mais seletivos para o proteassoma 20S do parasito.