PPBIOTEC - Programa de Pós-graduação em Biotecnologia
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Resultados da Pesquisa
Item Análise proteômica comparativa de amostras de Trypanosoma cruzi pertencentes aos genótipos TcII e TcVI, isoladas de pacientes com doença de Chagas crônica.(2017) Inácio, Luciana de Jesus; Borges, William de Castro; Lana, Marta de; Oliveira, Maykon Tavares de; Borges, William de Castro; Palmisano, Giuseppe; Veloso, Vanja MariaO Trypanosoma cruzi é um parasito da ordem Kinetoplastida, agente etiológico da doença de Chagas (DCh), uma enfermidade de evolução crônica progressiva que afeta os sistemas cardiovascular, gastrointestinal e nervoso do hospedeiro humano. Esse protozoário é um parasito intracelular obrigatório que apresenta quatro estágios evolutivos: formas epimastigotas e tripomastigotas metacíclicas no sistema digestivo do inseto vetor; formas amastigotas (intracelulares) e tripomastigotas sanguíneas que parasitam o hospedeiro mamífero. A espécie está subdividida em seis genótipos distintos ou discret typing units (DTUs), nomeados TcI a TcVI, e TcBat. Vários estudos foram conduzidos visando correlacionar a variabilidade genética do T. cruzi com sua biologia e as manifestações clínicas da DCh, e a proteômica representa uma abordagem interessante para estudar mudanças globais na expressão de proteínas entre os diferentes genótipos. O objetivo deste trabalho foi caracterizar alguns parâmetros biológicos por meio de ensaios in vitro e realizar a análise proteômica quantitativa de amostras de T. cruzi pertencentes aos genótipos TcII e TcVI isoladas de pacientes com doença de Chagas crônica, provenientes do Vale do Jequitinhonha, MG. Para este fim, cada amostra de T. cruzi foi cultivada em meio LIT para determinação da curva de crescimento ao longo de 20 dias. A taxa de metaciclogênese foi avaliada em meio Grace. Células “Vero” foram infectadas com tripomastigotas obtidas da diferenciação em meio Grace para avaliar as taxas de infectividade e de multiplicação intracelular de cada amostra nos tempos de 24, 48 e 72 horas de cultivo. Os proteomas das três amostras de epimastigotas de T. cruzi (1107 – TcII, 229 e 2119 – TcVI; em fase exponencial) foram analisados por nano-UHPLC-MS/MS. Para identificação, quantificação label free e comparação das proteínas, foi utilizado o software PEAKS, versão 8, e a categorização das proteínas foi realizada pelo software Blas2GO versão 4.1. Os resultados obtidos revelaram diferenças significativas entre os genótipos TcII e TcVI. A amostra do genótipo TcII apresentou maior área sob a curva na análise do crescimento em meio LIT, enquanto as taxas de metaciclogênese, infectividade e desenvolvimento intracelular foram maiores nas amostras do grupo genético TcVI. A análise proteômica shotgun permitiu a identificação de 3833 proteínas, dentre as quais 212 exibiram expressão diferencial. Dessas proteínas, a maioria encontrava-se com a expressão aumentada nos isolados do genótipo TcVI. Este trabalho permitiu apontar diferenças biológicas e metabólicas importantes entre os isolados investigados e a identificação de possíveis assinaturas proteicas dos genótipos TcII e TcVI.Item Avaliação in silico e in vitro do efeito tripanocida de óleos essenciais e desenvolvimento de sistemas nanoestruturados como alternativa terapêutica da doença de Chagas.(2019) Seibert, Janaína Brandão; Santos, Orlando David Henrique dos; Vieira, Paula Melo de Abreu; Alexander, Cameron; Santos, Orlando David Henrique dos; Vieira, Paula Melo de Abreu; Silva, André Talvani Pedrosa da; Costa, Daniela Caldeira; Coelho, Eduardo Antônio Ferraz; Santos, Silvana Maria ElóiA falta de uma terapêutica tripanocida eficiente, principalmente na fase crônica da doença de Chagas e sem a presença de efeitos adversos intensos impulsiona a pesquisa para o desenvolvimento de novos fármacos. As substâncias produzidas através do metabolismo secundário de plantas podem apresentar diferentes efeitos biológicos e serem utilizadas como princípios ativos no tratamento de doenças. Dessa forma, o objetivo desse trabalho foi caracterizar quimicamente os óleos essenciais extraídos das espécies Cymbopogon densiflorus, Cymbopogon nardus, Melaleuca leucadendron e Microlicia graveolens, bem como avaliar a atividade anti-Trypanosoma cruzi dos fármacos livres e após encapsulamento em sistemas nanoestruturados. A obtenção desses óleos ocorreu a partir da hidrodestilação das partes aéreas, com rendimentos em torno de 0,1 a 2,0% de acordo com a espécie. A caracterização realizada através da cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas permitiu a identificação de mais de 90% dos compostos, com presença majoritária de monoterpenos oxigenados. A partir da análise in silico foi possível prever inicialmente que todos os óleos em estudo apresentariam potencial contra o parasito T. cruzi. No entanto, na avaliação in vitro desta atividade utilizando a cepa Tulahuen, somente o óleo de folhas de C. densiflorus se revelou ativo, a partir de uma CI50 sobre o parasito equivalente a 60 μg/mL (IS= 3,8). No ensaio de permeabilidade de membrana do parasito, concentrações superiores a 30 μg/mL de óleo apresentaram diferenças em relação ao controle. Este resultado foi confirmado através da microscopia eletrônica de transmissão. Além disso, sistemas nanoemulsionados, lipossomais e micelares carregados de óleo essencial e/ou benznidazol foram desenvolvidos e apresentaram tamanho em escala nanométrica (<500 nm). A adição dos princípios ativos favoreceu a homogeneidade de distribuição de tamanho para todas as formulações. Além disso, potencial zeta negativo e um pH ácido também definiram as formulações. A estabilidade dos sistemas foi avaliada e apenas os lipossomas contendo ambos os fármacos foram instáveis. As formulações foram capazes de reproduzir a atividade tripanocida apresentada pelo óleo e benznidazol a partir de concentrações inferiores quando comparadas aos fármacos livres. No entanto, as micelas foram caracterizadas pelos maiores índices de seletividade e um efeito sinérgico foi comprovado quando ambos os fármacos foram encapsulados concomitantemente nessa forma farmacêutica. Sendo assim, os resultados desse trabalho demonstram o óleo essencial de folhas de C. densiflorus como candidato potencial ao tratamento da doença de Chagas, o qual é capaz de eliminar o T. cruzi in vitro a partir de baixas concentrações. Em adição, as formas micelares contendo benznidazol podem ser uma alternativa na quimioterapêutica chagásica tanto na sua forma simples, bem como, em combinação com o óleo essencial de C. densiflorus.Item Inovações na produção de enzimas do fungo Chrysoporthe cubensis e seus reflexos na sacarificação do bagaço de cana-de-açúcar.(2018) Albuquerque, Mariana Furtado Granato de; Rezende, Sebastião Tavares de; Guimarães, Valéria Monteze; Rezende, Sebastião Tavares de; Almeida, Maíra Nicolau de; Andrade, Milton Hércules Guerra de; Monteiro, Paulo Sérgio; Brandão, Rogélio LopesO presente trabalho avaliou o efeito de métodos de pré-tratamento, ainda não testados, na hidrólise do bagaço de cana realizada com coquetéis enzimáticos fúngicos produzidos on-site. Além disso, o extrato enzimático de C. cubensis foi melhorado, por meio de alterações em suas condições de cultivo, e as enzimas α-arabinofuranosidases desse fungo foram purificadas, caracterizadas e avaliadas na hidrólise do bagaço de cana-de-açúcar pré-tratado alcalino. Os melhores resultados mostraram que o prétratamento hidrotérmico permitiu a conversão de mais de 60% da glicana pelo blend enzimático C. cubensis-P.pinophilum, além de diminuir a necessidade de hemicelulases no processo. O farelo de trigo se destacou, em relação ao capim elefante e ao bagaço de cana-de-açúcar, como fonte de carbono no crescimento do C. cubensis. O melhor extrato enzimático, obtido a partir do crescimento do fungo em uma mistura do farelo de trigo e farinha de beterraba, na proporção 1:1, se mostrou mais completo e eficiente na sacarificação do bagaço de cana submetido ao pré-tratamento ácido ou alcalino, se comparado ao extrato enzimático obtido com farelo de trigo puro. A partir desse coquetel, foram purificadas e caracterizadas duas α-arabinofuranosidases, denominadas α-Ara1 e α-Ara2. As duas enzimas foram satisfatoriamente estáveis a 50 °C, com meiavidas de 68 e 77 horas, respectivamente, e apresentaram pH e temperatura ótimos próximos a 4,0 e 60 °C. A α-Ara1 foi identificada como membro da família GH51 e a αAra2 como uma GH54. Se comparada à α-Ara1, α-Ara2 apresentou maior atividade específica em diferentes substratos, além de maiores eficiências catalíticas ao atuar sobre substratos naturais e complexos, provavelmente devido à presença do domínio de ligação à carboidrato CBM42, presente na estrutura desse enzima. A suplementação do coquetel comercial Multifect® CL com a α-Ara2 aumentou 1,6 vezes e liberação de glicose e 3,6 vezes a produção de xilose. Resultado idêntico foi observado após a combinação do coquetel comercial com as duas α-arabinofuranosidases purificadas, o que indicou sinergismo entre as mesmas. Portanto, o presente estudo contribui para maior conhecimento dos efeitos de diferentes pré-tratamentos na atuação das enzimas produzidas por C. cubensis, bem como traz algumas inovações relacionadas ao processo de produção de enzimas desse fungo e ao estudo de novas α-arabinofuranosidases com potencial para aplicação na indústria de etanol lignocelulósico.Item Análise composicional e quantitativa do soroproteoma na infecção experimental por Schistosoma mansoni.(2019) Silva, Gustavo Gonçalves; Borges, William de Castro; Borges, William de Castro; Cardoso, Leonardo Máximo; Borges, Marcia HelenaA esquistossomose é uma doença tropical negligenciada presente em 78 países. Cerca de 200 milhões de pessoas estão infectadas com parasitos do gênero Schistosoma, expondo um número muito maior de indivíduos ao risco de infecção. No decorrer da doença os vermes regurgitam os subprodutos de sua digestão, liberando proteínas na corrente sanguínea do hospedeiro. O conteúdo proteico do plasma é uma excelente fonte de informação para compreender melhor a doença no hospedeiro vertebrado. Abordagens proteômicas utilizando o plasma de indivíduos infectados podem contribuir para o entendimento de como os parasitos modificam ou induzem alterações no proteoma plasmático do hospedeiro. Essas investigações também podem ser úteis na busca de novos biomarcadores da esquistossomose. O objetivo deste projeto foi avaliar o proteoma plasmático e soroproteoma de camundongos na infecção experimental por Schistosoma mansoni, para o entendimento da relação parasito-hospedeiro e prospecção de novos alvos para o diagnóstico da doença. Amostras de plasma e soro de camundongos BALB/c e C57BL6 infectados e não infectados, foram colhidas nos períodos 5 e 7 semanas de infecção. As amostras foram investigadas utilizando 1D e 2D SDS PAGE e Western Blotting. Adicionalmente, proteômica em larga escala, baseada em espectrometria de massas foi utilizada para avaliação composicional e quantitativa das amostras investigadas. Em paralelo, métodos para aumentar a exploração do proteoma sérico foram utilizados para o enriquecimento de constituintes de baixa abundância, no intuito de aumentar o repertório de moléculas relacionadas à infecção. Os perfis uni e bidimensional das amostras de plasma e soro demonstraram diferenças entre as condições controle e infectado nos dois períodos investigados. Com a análise proteômica composicional em larga escala realizada por meio de espectrometria de massas, obteve-se a identificação de 362 constituintes. A análise quantitativa demonstrou 129 proteínas diferencialmente expressas, das quais 117 apresentaram aumento de expressão nas condições infectadas. A maioria das moléculas reguladas positivamente nessas condições pode estar associada com a resposta do hospedeiro frente à presença conjunta de parasitos e ovos nos tecidos. A dominância de algumas proteínas plasmáticas representa um desafio para a identificação de moléculas menos abundantes, os métodos de depleção empregados nesse estudo podem representar novas estratégias para identificação de biomarcadores da infecção por S. mansoni.Item Estudo da interação molecular da Nitazoxanida por meio de uma abordagem proteômica e efeitos sobre danos teciduais.(2019) Barroso, Nauhara Vieira de Castro; Andrade, Milton Hércules Guerra de; Andrade, Milton Hércules Guerra de; Isoldi, Mauro César; Giunchetti, Rodolfo CordeiroA Nitazoxanida (NTZ) é um antiparasitário de amplo espectro de ação utilizado no tratamento de infecções intestinais ocasionados por helmintos, protozoários e gastroenterites virais causadas por Rotavírus e Norovírus. Além disso, estudos demonstraram que a NTZ apresenta atividades antibacterianas, anti-inflamatórias, antivirais e antitumorais. O amplo espectro de atividade está relacionado tanto a NTZ, quanto ao seu metabólito ativo Tizoxanida (TIZ). No entanto, alguns efeitos colaterais podem ser observados após ingestão desse fármaco. Poucos estudos foram realizados com o objetivo de investigar as interações da NTZ com proteínas de mamíferos e o seu efeito em células normais, tendo em vista seu efeito antiproliferativo em células tumorais. Diante disso, no presente trabalho, a TIZ foi imobilizada em Sepharose 4B e submetida a ligação com homogenatos de encéfalo, rim, fígado e intestino de ratos Wistar, com o objetivo de isolar e identificar proteínas que interagem de forma específica com a TIZ. Além disso, foi avaliado o efeito antiproliferativo da NTZ em células normais, por meio de ensaio de reparação tecidual em camundongos Swiss. Por meio da espectrometria de massas foram identificadas 60 enzimas com critérios de elevada estringência, que podem ter suas atividades alteradas pela NTZ. A modelagem molecular realizada com a NTZ, TIZ e as enzimas Glutathione S-transferase P1 (GSTP1), Glutathione S-transferase M2 (GSTM2), NAD(P)H dehydrogenase [quinone] 1 (NQO1), Fumarylacetoacetase (FAH) e Hydroxysteroid (17-beta) dehydrogenase 10 (17β-HSD10), permitiu a proposição do sítio de ligação dessas enzimas que justificam uma inibição competitiva pela NTZ/TIZ. A modelagem com Protein disulfideisomerase (PDI), permitiu a proposição de uma inibição na PDI humana pela TIZ, por meio do impedimento de estabilização da sua conformação no estado reduzido. Esses resultados colocam a GSTP1, GSTM2, NQO1 e PDI como possíveis alvos dos efeitos antitumorais que foram demonstrados para NTZ, uma vez que estas enzimas são essenciais para manutenção das células tumorais; a FAH como possível alvo de efeitos colaterais em função do acúmulo do seu metabólito tóxico; e a 17β-HSD10 como possível alvo de novas alternativas para o tratamento do Alzheimer, devido ao possível envolvimento dessa enzima no desenvolvimento da doença. Além disso, nossos estudos de reparação tecidual em camundongos tratados com NTZ 10-3M, NTZ 10-5M e NTZ 10-6M, demonstraram macroscopicamente que não houve um efeito modificador da proliferação tecidual que limitasse o fechamento das áreas das feridas, e que microscopicamente o grupo NTZ 10-3M apresentou feridas num grau de maturidade mais avançado, compatível com o estágio proliferativo do processo cicatricial em comparação ao grupo controle. Os resultados desse trabalho corroboram com os mecanismos dos efeitos antitumorais descritos para esse fármaco, interpretam as interações moleculares para auxiliar no desenvolvimento de novas estruturas e sugerem a possibilidade de aplicação no tratamento da doença de Alzheimer.Item Desenvolvimento de carreadores lipídicos constituídos por lípides da flora amazônica com propriedade antioxidante contendo fragrâncias naturais para melhora do odor corpóreo relativo ao envelhecimento cutâneo.(2019) Kaufmann, Giana Thais; Santos, Orlando David Henrique dos; Goulart, Gisele Assis Castro; Santos, Orlando David Henrique dos; Goulart, Gisele Assis Castro; Silva, Elton Luiz; Carneiro, Guilherme; Souza, Gustavo Henrique Bianco de; Vieira Filho, Sidney AugustoCom o envelhecimento cronológico há uma redução dos sistemas intrínsecos antioxidantes da pele, resultando em danos cutâneos e geração de compostos responsáveis pelo odor característico da idade. No intuito de minimizar esses danos, propomos o desenvolvimento de nanopartículas lipídicas (nanopartículas lipídica sólidas- NLS e carreadores lipídicos nanoestruturados – CLN) constituídos de manteigas e óleos extravirgens provenientes da flora amazônica contendo fragrâncias naturais com habilidade de mascarar e harmonizar o odor relativo ao envelhecimento. Para composição da matriz lipídica das nanopartículas, as manteigas de ucuúba e de muru-muru e os óleos de patauá e de castanha-do-Brasil foram avaliados quanto às suas características físico-químicas, composição da fração insaponificável e em ácidos graxos e atividade antioxidante pelos métodos de DPPH, ABTS e proteção do ácido palmitoleico (AP) frente ao esqualeno hidroperóxido (EHP). A manteiga de ucuúba apresentou a maior concentração de fitosteróis (287 mg EC/100g), de compostos fenólicos totais (775 mg EAG/100g) e maiores índices de atividade antioxidante: EC50 de 0,83 mg/mL e 18,74 g ET/kg (DPPH) e 18,87 g ET/kg (ABTS). Com exceção da manteiga de muru-muru, todos os materiais demonstraram atividade antioxidante similar ao BHT frente ao EHP. Foram desenvolvidas 7 fragrâncias com óleos essenciais para cada gênero e avaliadas quanto a capacidade de mascarar e/ou harmonizar o odor relativo a idade e quanto à atividade antioxidante. Todas demonstraram capacidade de mascarar o odor do 2-nonenal sem diferenças significativas (p>0,05), porém as fragrâncias F4 e M4 potencializaram a harmonização do odor deste aldeído, sendo selecionadas. Na otimização da produção das NLS e CLN, com ou sem adição de F4 e M4, foram avaliados 7 tensoativos polihidroxilados, duas técnicas de produção (homogeneização a quente com sonda de ultrassom de alta potência - US e homogeneização por alta pressão - HAP) e duas condições de resfriamento (banho de gelo - BG e temperatura ambiente - TA). Todas as formulações foram avaliadas quanto a eficiência de encapsulação (EE) e recuperação do processo (RP) por CG-EM, tamanho de partículas, índice de polidispersão (PDI), potencial zeta (PZ) e pH em dois tempos: T0 (48 horas após a produção) e T65 (65 dias após a produção). As nanopartículas também foram avaliadas por fracionamento de fluxo assimétrico (AF4), por microscopia eletrônica de transmissão e atividade antioxidante frente ao EHP. Dentre as formulações avaliadas e condições de processo, os CLN-M4 BG apresentaram os melhores resultados: EET0 de 88,8%, EET65 de 63,7% e RP de 92,2. As formulações com F4 produzidas por HAP apresentaram EET0 de 97,5%, EET65 de 73,1% e RP de 32,8%. Todas as formulações produzidas apresentaram tamanho médio inferiores de 170 nm, distribuição monodispersa (≤ 0,3) e PZ acima de 30 mv. Adicionalmente, também apresentaram atividade antioxidante contra o EHP similar ao BHT, o que as torna promissoras como agentes antioxidantes para minimização dos processos oxidativos cutâneos e como sistema preventivo na formação do odor relativo a idade.Item Síntese e funcionalização de nanopartículas inalatórias e avaliação in vitro para tratamento de tuberculose.(2018) Carneiro, Simone Pinto; Santos, Orlando David Henrique dos; Fattal, Elias; Santos, Orlando David Henrique dos; Faraco, André Augusto Gomes; Rúbio, Karina Taciana Santos; Ferreira, Lucas Antônio Miranda; Cota, Renata Guerra de SáA tuberculose é uma doença bacteriana infecciosa considerada um grave problema de saúde pública, por ser classificada como a principal causa de morte no mundo por um único agente infeccioso. A OMS recomenda um protocolo de tratamento eficaz, porém, a terapia convencional requer a administração de altas doses diárias de cada medicamento pela via oral para uma resposta satisfatória do paciente, o que culmina na emergência de efeitos adversos graves, reduzindo a adesão à terapia. Neste contexto, o objetivo deste trabalho é sintetizar e funcionalizar nanopartículas inalatórias destinadas ao tratamento de tuberculose e avaliar, in vitro, suas propriedades físico-químicas, toxicidade e atividade biológica. O trabalho empregou estratégias distintas para o desenvolvimento de nanopartículas contendo fármacos antituberculosos. Uma das estratégias consistiu na aplicação de uma metodologia físico-química, em que carreadores lipídicos nanoestruturados de rifampicina foram obtidos pelo método da microemulsão. Esta nanoformulação foi funcionalizada com um peptídeo modificado baseado na sequência da tuftsina, o qual foi previamente sintetizado em fase sólida e, em seguida, acoplado à superfície das nanopartículas para vetorizar o carreador (NP-pRIF). As nanopartículas foram caracterizadas, confirmando a obtenção de um sistema de liberação monodisperso e estável. Os ensaios em cultura de células demonstraram que a NP-pRIF apresentou um potencial de internalização pelos macrófagos significativamente maior que as nanopartículas de rifampicina sem o peptídeo (NP-RIF). Os estudos de citotoxicidade constataram o potencial não-citotóxico de ambas as formulações (NP-pRIF e NP-RIF) em todas as concentrações testadas. Ainda, a eficácia da formulação foi testada frente ao Mycobacterium tuberculosis e apresentou uma concentração inibitória mínima 2 vezes menor que a requerida por uma solução do fármaco puro. Para viabilizar a administração pulmonar, as suspensões de nanopartículas foram acrescidas de manitol e submetidas à secagem por atomização por spray-drying, dando origem a um pó fino, fluido e caracterizado por microscopia eletrônica de varredura como micropartículas esféricas, com tamanho de partícula entre 2 – 10 μm. Os testes in vitro demonstraram o potencial de redispersão das micropartículas em água e liberação das nanopartículas alojadas em seu interior. A outra estratégia abordada neste trabalho envolveu o emprego de uma metodologia química para proceder à síntese de dois conjugados constituídos por um fármaco antituberculoso (rifampicina ou ácido pirazinoico) e o poli(ácido málico), através de reações de esterificação. Em seguida, os conjugados se auto-agregaram em água para a obtenção dos respectivos nanoconjugados (NC-RIF e NC-PA, respectivamente), confirmados pelas imagens de microscopia eletrônica de transmissão. Os testes em cultura de células demonstraram que ambos os nanoconjugados foram eficientemente internalizados pelos macrófagos e que as formulações não apresentaram potencial citotóxico para a maioria das concentrações testadas. Estas formulações serão futuramente secas em spray-drying para obtenção de micropartículas e viabilização da administração pulmonar. Em conclusão, ambas as estratégias empregadas neste trabalho foram eficientes na obtenção de nanocarreadores inovadores e com potencial para contribuição na otimização do tratamento da tuberculose.Item Proteômica quantitativa baseada em espectrometria de massas para estudo do trato alimentar de Schistosoma mansoni com ênfase na glândula esofagiana e suas secreções.(2018) Neves, Leandro Xavier; Borges, William de Castro; Wilson, R. Alan; Borges, William de Castro; Palmisano, Giuseppe; Castro, Ieso de Miranda; Cota, Renata Guerra de Sá; Marco, Ricardo deA esquistossomose é uma doença tropical negligenciada que afeta mais de 240 milhões de pessoas em 78 países. Apesar dos esforços para erradicação da doença, fatores como baixa cobertura dos programas de tratamento quimioterápico, métodos diagnóstico pouco sensíveis e reinfecções em regiões endêmicas, constituem desafios para o controle da transmissão. O desenvolvimento de vacinas contra schistosomas constitui uma ferramenta alternativa de combate à doença, porém, a identificação de antígenos protetores tem sido um grande desafio. Neste sentido, destaca-se o modelo de auto cura da infecção em macaco Rhesus (Macaca mulatta), no qual observa-se eliminação de parasitos após uma resposta humoral direcionada às interfaces do parasito, como tegumento e secreções da glândula esofagiana. Neste contexto, o presente trabalho teve como objetivo geral a caracterização proteômica em larga escala de produtos da glândula esofagiana e demais secreções do trato alimentar de S. mansoni para proposição de novos alvos vacinais. Uma abordagem quantitativa avaliou a presença de proteínas de interface em homogenato solúvel de vermes adultos, revelando uma baixa representatividade de moléculas de interesse nessa fração. A partir disso, um método de enriquecimento tecidual foi utilizado para a análise detalhada do esôfago de vermes machos adultos. As análises shotgun quantitativas apontaram 628 grupos de proteínas enriquecidos na região esofagiana, incluindo Microexon genes (MEG), hidrolases, glicosil transferases e proteínas para transporte vesicular. Ademais, essa abordagem permitiu a detecção de proteoformas de MEGs geradas por substituição e/ou deleção de resíduos de aminoácidos. Nove proteínas expressas na glândula esofagiana foram selecionadas para quantificação absoluta por QconCAT. A MEG-12 apresentou a maior concentração entre os alvos quantificados. A estimativa do número de cópias por célula das proteínas secretadas sugere que tais moléculas constituem alvos abundantes neste subproteoma. Por último, a caracterização proteômica do sobrenadante de cultura de S. mansoni resultou na detecção de um repertório expandido de proteínas do trato alimentar, incluindo MEGs esofagianas, reforçando a eventual exposição das secreções nessa interface parasito-hospedeiro. Em conjunto, as abordagens proteômicas de caracterização da região esofagiana e trato alimentar de S. mansoni resultaram na identificação de moléculas com potencial aplicação biotecnológica no desenvolvimento de vacinas, bem como alvos terapêuticos.Item Efeito da dieta rica em carboidratos simples e do treinamento físico na expressão de biomarcadores epigenéticos renais em ratos.(2019) Oliveira, Deborah Campos; Cota, Renata Guerra de Sá; Barboza, Natália Rocha; Cota, Renata Guerra de Sá; Nogueira, Katiane de Oliveira Pinto Coelho; Almeida, Roberto Farina deAtualmente, não se pode afirmar como a reprogramação gênica acontece. Sabe-se que fatores ambientais como o treinamento físico e dieta podem influenciar a modulação epigenética dos tecidos levando a alterações da expressão gênica. O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito do consumo crônico de uma dieta isocalórica rica em carboidratos simples e do treinamento aeróbico de natação com carga sobre o desenvolvimento da obesidade e a modulação epigenética no tecido renal de animais. Rattus norvegicus da linhagem Wistar, machos recém-desmamados com aproximadamente 35 dias de vida, foram divididos entre quatro grupos: 1) sedentário dieta controle, 2) treinado dieta controle, 3) sedentário dieta rica em carboidratos simples e 4) treinado dieta rica em carboidratos simples. Os grupos 1 e 2, foram alimentados com ração comercial (Nuvilab) enquanto que os grupos 3 e 4 foram alimentados com uma ração rica em carboidratos simples. O protocolo de treinamento de natação com carga consistiu de 90 sessões (18 semanas) de 1 hora durante 5 dias da semana com aumento progressivo da carga. Foram avaliados o consumo calórico, peso corporal, pressão sanguínea, peso dos órgãos, coxins adiposos, índice de Lee, parâmetros hematológicos, bioquímicos e histológicos. A expressão dos marcadores epigenéticos: (i) sirtuínas 1 a 7, (ii) DNA metil transferases e (iii) desmetilases foram avaliados utilizando a técnica de PCR em tempo real. Também foram avaliados a expressão das enzimas envolvidas ao estresse oxidativo (SOD e Catalase) bem como a atividade SOD total. Os animais com obesidade induzida pela dieta rica em carboidratos simples apresentaram os níveis séricos de triglicérides, o índice de Lee e índice de adiposidade aumentados. Por outro lado, o treinamento físico associado à dieta rica em carboidratos simples induziu um aumento na expressão relativa dos genes MnSOD, ZnSOD, Catalase e das sirtuínas 3, 4, 5 e 6. Quanto a expressão de mRNA de metilases e desmetilases no tecido renal, observamos que o treino aumentou a expressão relativa de Dnmt3a, Dnmt3b, Tet2 e Tet3. Já a dieta rica em carboidratos simples diminuiu a expressão de Dnmt1 e Dnmt3b. Em conjuntos, os dados obtidos permitem concluir que a associação da dieta rica em carboidratos simples e treinamento aeróbico de natação induziu aumento da expressão das sirtuínas mitocondriais 3, 4 e 5 sugerindo uma melhora na capacidade oxidativa do tecido renal. A associação dieta rica em carboidratos simples e treinamento aeróbico de natação induziu o aumento na expressão das enzimas envolvida na metilação de novo e na desmetilação, sugerindo reprogramação epigenética ao nível do DNA. Os genes testados podem apresentar um possível potencial como biomarcadores em resposta e acompanhamento ao agravo do metabolismo no tecido renal em resposta a instalação de um quadro de obesidade.Item Caracterização de genes talin e os efeitos do silenciamento por RNAi usando miR-190 em Schistosoma mansoni.(2019) Paiva, Thales Henrique de; Cota, Renata Guerra de Sá; Cota, Renata Guerra de Sá; Jeremias, Wander de Jesus; Borges, William de CastroA esquistossomose é uma doença parasitária de grande importância econômica e social afetando aproximadamente 200mi/ano de pessoas no mundo. Causada pelo nematódeo do gênero Schistosoma (especificamente neste estudo o S. mansoni por ser o de maior prevalência no Brasil), continua sendo um desafio para a comunidade científica sua compreensão ampla e descoberta de novas tecnologias diagnósticas e terapêuticas. Este estudo realizado trata da caracterização in vitro e in silico da proteína talin bem como avaliar os efeitos ultraestruturais após silenciamento in vitro por seu microRNA intrônico miR-190 em vermes adultos. As proteínas Talinas são uma família de proteínas grandes adaptadoras que conectam uma família de moléculas de adesão celular chamadas integrinas aos filamentos de F-actina do citoesqueleto. Há dois tipos de genes Talin em vertebrados. Talin 1 é essencial para o processo de adesão celular mediado por integrinas enquanto o papel do Talin 2 é desconhecido. Duas entradas da proteína talina previamente anotadas no genoma do S. mansoni, identificadas como Smp_167010 e Smp_142630 foram objeto desse estudo. Análises de predição estrutural in silico foram feitas e observado um padrão diferencial de domínios funcionais (PFAM), bem como alto grau de similaridade e identidade com seus ortólogos (SWISS-MODEL) e os dados indicam que as duas entradas não são oriundas de splicing alternativo e sim de diferenciação e especiação com valores de bootstrap próximo ou atingindo 100 (filogenia). Amostras de vermes adultos machos e fêmeas, cercárias, esquistossômulos mecanicamente transformados (EMT3,5h – EMT-24h) e ovos de S. mansoni foram utilizados para traçar o perfil de expressão gênica por qRT-PCR usando o gene constitutivo EIF4E como controle endógeno. A expressão gênica relativa foi determinada pelo método 2 –ΔCq. A análise estatística foi realizada utilizando o teste one-way ANOVA (Tukey) com P<0,01. Foi observado um perfil de expressão gênica diferencial em Smp_167010 e Smp_142630 tanto entre as fases de vida do verme quanto entre os dois genes. Foi ainda observado alterações ultraestruturais significativas em vermes adultos machos expostos ao miR-190 em comparação ao controle com a presença de descamação, bolhas e fissuras enquanto nenhuma alteração em fêmeas foi identificado. Em conclusão vimos que o S. mansoni possui dois genes talin que indicam ter grande importância em sua biologia e que há retroregulação do gene talin por seu microRNA intrônico miR-190 que quando ofertado em meio livre interfere em processos biológicos e causa danos estruturais visíveis.