PPBIOTEC - Programa de Pós-graduação em Biotecnologia
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Item Proteômica quantitativa baseada em espectrometria de massas para estudo do trato alimentar de Schistosoma mansoni com ênfase na glândula esofagiana e suas secreções.(2018) Neves, Leandro Xavier; Borges, William de Castro; Wilson, R. Alan; Borges, William de Castro; Palmisano, Giuseppe; Castro, Ieso de Miranda; Cota, Renata Guerra de Sá; Marco, Ricardo deA esquistossomose é uma doença tropical negligenciada que afeta mais de 240 milhões de pessoas em 78 países. Apesar dos esforços para erradicação da doença, fatores como baixa cobertura dos programas de tratamento quimioterápico, métodos diagnóstico pouco sensíveis e reinfecções em regiões endêmicas, constituem desafios para o controle da transmissão. O desenvolvimento de vacinas contra schistosomas constitui uma ferramenta alternativa de combate à doença, porém, a identificação de antígenos protetores tem sido um grande desafio. Neste sentido, destaca-se o modelo de auto cura da infecção em macaco Rhesus (Macaca mulatta), no qual observa-se eliminação de parasitos após uma resposta humoral direcionada às interfaces do parasito, como tegumento e secreções da glândula esofagiana. Neste contexto, o presente trabalho teve como objetivo geral a caracterização proteômica em larga escala de produtos da glândula esofagiana e demais secreções do trato alimentar de S. mansoni para proposição de novos alvos vacinais. Uma abordagem quantitativa avaliou a presença de proteínas de interface em homogenato solúvel de vermes adultos, revelando uma baixa representatividade de moléculas de interesse nessa fração. A partir disso, um método de enriquecimento tecidual foi utilizado para a análise detalhada do esôfago de vermes machos adultos. As análises shotgun quantitativas apontaram 628 grupos de proteínas enriquecidos na região esofagiana, incluindo Microexon genes (MEG), hidrolases, glicosil transferases e proteínas para transporte vesicular. Ademais, essa abordagem permitiu a detecção de proteoformas de MEGs geradas por substituição e/ou deleção de resíduos de aminoácidos. Nove proteínas expressas na glândula esofagiana foram selecionadas para quantificação absoluta por QconCAT. A MEG-12 apresentou a maior concentração entre os alvos quantificados. A estimativa do número de cópias por célula das proteínas secretadas sugere que tais moléculas constituem alvos abundantes neste subproteoma. Por último, a caracterização proteômica do sobrenadante de cultura de S. mansoni resultou na detecção de um repertório expandido de proteínas do trato alimentar, incluindo MEGs esofagianas, reforçando a eventual exposição das secreções nessa interface parasito-hospedeiro. Em conjunto, as abordagens proteômicas de caracterização da região esofagiana e trato alimentar de S. mansoni resultaram na identificação de moléculas com potencial aplicação biotecnológica no desenvolvimento de vacinas, bem como alvos terapêuticos.Item Cromatografia de afinidade pelo ácido ε-aminocapróico para purificação e depleção de anticorpos em condições otimizadas para preservação estrutural e funcional.(2014) Neves, Leandro Xavier; Borges, William de Castro; Andrade, Milton Hércules Guerra de; Borges, William de Castro; Fonseca, Cristina Toscano; Castro, Ieso de MirandaImunoglobulinas ou anticorpos são glicoproteínas produzidas pelas células B. Estas moléculas podem ser encontradas ancoradas na membrana plasmática da célula produtora ou em fluidos corporais, como sangue e líquido ascítico, na sua forma secretada. Sua estrutura tridimensional revela uma organização básica correspondente à associação das cadeias polipeptídicas leve e pesada. A capacidade de reconhecimento molecular altamente específico faz dessas moléculas poderosas ferramentas nas ciências biomédicas, sendo úteis nas pesquisas científicas, métodos de diagnóstico e imunoterapias. Anticorpos são obtidos a partir de soro de animais ou culturas celulares após rigorosas etapas de purificação, que se destinam à remoção de contaminantes comuns como vírus, pirogênios e proteínas abundantes. Particularmente, o isolamento de anticorpos utilizando cromatografia de afinidade permite sua purificação e depleção em amostras de plasma, precedendo as análises proteômicas. Embora vários procedimentos para purificação/depleção de anticorpos estejam atualmente disponíveis, algumas limitações como especificidade restrita à determinadas classes e espécies e alto custo, justificam o desenvolvimento de métodos alternativos. O objetivo deste trabalho foi a síntese de matrizes cromatográficas, utilizando ácido ε-aminocapróico (AEAC), para purificação e depleção de anticorpos. Quatro, das cinco, matrizes obtidas exibiram especificidade por anticorpos plasmáticos humanos e IgY da gema do ovo de Gallus gallus. O emprego de condições cromatográficas brandas, especialmente eluição em pH fisiológico e baixa força iônica, permitiu a recuperação de anticorpos funcionais, como revelado por Western blotting. O perfil eletroforético bidimensional, seguido da análise por espectrometria de massas, revelou uma heterogeneidade de isoformas e a purificação dos isotipos humanos IgG1,2,3,4, IgA1, IgD, IgM e IgY de Gallus gallus, com alto grau de pureza. Além disso, a imobilização do ácido ε-aminocapróico em micropartículas magnéticas constitui uma estratégia bem sucedida de depleção plasmática de anticorpos, a partir de pequenos volumes. Por último, a avaliação do desempenho das matrizes sintetizadas revelou a melhor capacidade de retenção da matriz pré-ativada NHS-AEAC (30 mg de anticorpo/g). Concluímos que o acoplamento do ácido ε-aminocapróico em suportes cromatográficos constitui uma alternativa para a purificação e depleção de anticorpos plasmáticos e IgY, revelando-se como uma nova ferramenta de interesse biotecnológico.