PPBIOTEC - Programa de Pós-graduação em Biotecnologia

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Correlação entre capacidade ectonucleotidásica de isolados de Lactobacillus e a produção de citocinas por células dendríticas.
(2014) Pereira, Hellem Crhistina Damazo; Afonso, Luís Carlos Crocco; Neumann, Elisabeth
Probióticos são microrganismos vivos que, quando administrados de forma adequada, agregam benefícios à saúde do hospedeiro. Várias espécies do gênero Lactobacillus apresentam efeito probiótico comprovado e são importantes moduladoras do sistema imune intestinal. Os probióticos estimulam as células dendríticas (DCs) a produzirem citocinas que diferenciam as células T em Th1, Th2, Th17 ou Treg. As ectonucleotidases são enzimas capazes de hidrolisar nucleotídeos di e trifosfatados. Essas ectoenzimas são importantes para a modulação da resposta imune intestinal devido à hidrólise de ATP, que quando aumentada no meio extracelular é considerada uma molécula inflamatória. Por outro lado o acúmulo de adenosina, através da hidrólise de ATP em AMP, pela 5’-nucleotidase, estimula a resposta anti-inflamatória. O objetivo do trabalho foi relacionar a atividade ectonucleotidásica de diferentes linhagens de Lactobacillus com a capacidade de ativação de DCs e a produção de citocinas. Os Lactobacillus foram incubados com ATP, ADP ou AMP e os níveis de hidrólise foram avaliados através da liberação de fosfato inorgânico (Pi). Demonstrouse que os lactobacilos hidrolisam ATP diferentemente, dependendo da linhagem, sendo que Lactobacillus mali L.11 e Lactobacillus acidophilus L.36 apresentaram maior capacidade de hidrólise de ATP. Não foi observado hidrólise significativa de ADP e AMP. Ao agruparmos as linhagens com e sem atividade, foi possível verificar o aumento significativo da atividade de L. mali L.11 e L. acidophilus L.36 quando comparado às linhagens que apresentaram pouca atividade ectonucleotidasica. Além disso, as DCs foram estimuladas com os lactobacilos, por 20 horas e os resultados dessa estimulação demonstrou que as linhagens não alteraram. Além disso, as DCs foram estimuladas com Lactobacillus, por 20 horas e não demonstrou alteraração na expressão de CD40, CD86 e MHCII. Por fim observou-se a produção de citocinas após a estimulação por 20 horas. Houve um aumento de IL-6, TNF- α e IL-10 em relação às DCs não estimuladas. De maneira interessante, IL-12 teve a produção aumentada quando da estimulação de DC com L. mali L.10, que também mostrou baixa capacidade de hidrolisar ATP. Curiosamente, L. mali L.11 e L. acidophilus L.36 mostraram uma diminuição significativa da produção de IL-12, o que pode está relacionado com a alta capacidade de hidrólise dessas cepas. Conclui-se então que Lactobacillus possuem capacidade ectonucleotidásica diferenciada e que a hidrólise de ATP pode ser relacionada com a produção de citocinas por DCs e, consequentemente, com a diferenciação de linfócitos T durante a resposta imune intestinal.
A inibição do proteassomo como alvo para a sensibilização de T. cruzi via processos redox.
(2018) Coelho, Aline Meireles; Garcia, Camila Carrião Machado; Garcia, Camila Carrião Machado; Tahara, Erich Birelli; Afonso, Luís Carlos Crocco
O Trypanosoma cruzi é um protozoário flagelado unicelular, causador da doença de Chagas. Durante seu ciclo de vida, o parasito consegue evadir sistemas de defesas, como macrófagos, tolerando altas doses de espécies reativas. Alguns dos sistemas de defesa do parasito passam pela alta capacidade de tolerar danos no DNA, ativação de vias de reparo muito eficientes e detoxificação de proteínas oxidadas pelo complexo ubiquitina-proteassomo. Dados recentes têm demonstrado que o não funcionamento do proteassomo é altamente tóxico induzindo morte significativa dos parasitos. Atualmente, alguns trabalhos têm relacionado a participação do proteassomo em mecanismos de reparo de DNA, o que se torna um alvo biotecnológico muito interessante. Com isso, o objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito da inibição do proteassomo como um potencial alvo biotecnológico em T. cruzi frente a induções de danos no DNA e recrutamento de vias de reparo de DNA. Para isso, realizamos testes de toxicidade da cepa CL Brener na forma epimastigota com o proteassomo inibido em conjunto com diferentes dosagens de peróxido de hidrogênio, com a finalidade de induzir processos redox, e com o crotonaldeído, um aldeído formado como subproduto de lipoperoxidação, que causa alquilação nas bases nitrogenadas da fita de DNA e aminoácidos. De acordo com os resultados, o efeito da inibição do proteassomo induz maior morte celular em parasitos tratados com peróxido de hidrogênio. O que provavelmente está relacionado diretamente com uma possível participação do proteassomo em mecanismos de reciclagem de proteínas não funcionais, principalmente oxidadas ou para a processividade da vias de reparo de DNA.
O papel da e-NTPDase de Leishmania nos processos de adesão, internalização e modulação da resposta em macrófagos.
(Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós Graduação, Universidade Federal de Ouro Preto., 2011) Gomes, Rodrigo Saar; Afonso, Luís Carlos Crocco
As NTPDases são enzimas com a habilidade de hidrolisar nucleotídeos di e trifosfatados sob estímulo de íons bivalentes (Ca2+ ou Mg2+) e são caracterizadas pela presença de regiões altamente conservadas (ACR1 a ACR5). A maior parte dessas enzimas é encontrada ligada à membrana e são conhecidas como ecto-nucleotidades. São encontrados em inúmeros tipos celulares, incluindo protozoários, como parasitos do gênero Leishmania. Possuem importante papel na modulação da resposta imune devido à hidrólise de ATP, conhecida molécula inflamatória, e consequente acúmulo de adenosina, pela ação subsequente da 5’-nucleotidase na quebra de AMP, que, por sua vez, estimula resposta antiinflamatória. Sabe-se, ainda, do importante papel das NTPDases no processo de adesão e internalização de parasitos em células hospedeiras. O presente trabalho teve por objetivo avaliar o papel das e-NTPDases de Leishmania nos processos de adesão, internalização e modulação da resposta em macrófagos. Macrófagos provenientes do peritônio de camundongos C57BL/6 foram infectados com L. amazonensis tratados com anticorpos anti-NTPDase, e os resultados demonstraram redução na porcentagem de células contendo parasitos aderidos após 30 minutos. Além disso, competição com e-NTPDase recombinante reduziu a adesão e internalização de parasitos aos macrófagos. A modulação da expressão dessas enzimas através do tratamento com adenina ou suramina no parasito também altera esses parâmetros. De forma interessante, nas células que foram infectadas, o número de parasitos por célula é o mesmo nos diferentes grupos, sugerindo que populações diferentes de macrófagos possam ter níveis diferenciados de expressão de receptores desconhecidos pra e-NTPDase. Para análise de modulação da resposta macrofágica, células foram incubadas com e-NTPDase recombinante (rNTPDase). Os dados demonstram redução na produção de óxido nítrico (NO) por células tratadas com rNTPDase. Além disso, observou-se redução de citocinas como IL-10, IL-12 e aumento de TGF-β, demonstrando que a ligação de e-NTPDase de Leishmania é capaz de modelar as diferentes funções do macrófago. E, por fim, observou-se que células tratadas com rNTPDase perdem, após 30 minutos, a capacidade fagocítica. Conclui-se, portanto, que a e-NTPDase de Leishmania é uma importante molécula de adesão e consequente internalização do parasito pelos macrófagos e que essa ligação é capaz de alterar o padrão de resposta dessas células, sendo indicativo de que a e-NTPDase é mais uma molécula de superfície de Leishmania envolvida na subversão da resposta imune contra o parasito, e, consequentemente, no favorecimento da infecção.