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Análise comparativa da expressão gênica nas cepas selvagem W303 e pkc1∆ de Saccharomyces cerevisiae durante o processo de desrepressão metabólica.
(Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós Graduação, Universidade Federal de Ouro Preto., 2007) Tótola, Antônio Helvécio; Brandão, Rogélio Lopes
A levedura Saccharomyces cerevisiae possui uma via MAP quinase de transdução de sinais composta por Pkc1p, Bck1p, Mkk1p e Mkk2p, e Mpk1p. Já foi descrito que esta via está envolvida no controle da integridade da parede celular, na resposta ao estresse osmótico, no crescimento de pseudo-hifas e no controle do metabolismo de carbono. Neste trabalho investigamos a participação de Pkc1p no controle da expressão de genes envolvidos no metabolismo de carbono. Para isto, fizemos uma analise da expressão gênica global através de microarranjos de DNA comparando a resposta global sob condições de repressão e desrepressão metabólica no mutante a pkc1∆ e na cepa selvagem correspondente W303. Os resultados obtidos indicaram uma diferença significativa na expressão global dos genes nas duas cepas analisadas. Vinte e oito genes envolvidos no metabolismo de carbono foram selecionados para validação por RT-PCR e os resultados confirmaram que sete genes foram mais expressos na cepa W303 quando comparada com a cepa e quatro genes foram mais expressos na cepa pkc1 ∆ quando comparada com a cepa selvagem. Análises “In silico” apontaram três fatores de transcrição Sok2p, Crz1p and Gcr1p, que podem estar envolvidos no controle da expressão gênica por Pkc1p. Experimentos utilizando plasmídeos contendo o gene da β- galactosidase sob controle dos promotores dos genes CYC1, HXT1 e SUC2 mostraram que a expressão destes genes se apresentava diminuída na cepa pkc1∆ para o gene HXT1, aumentada para o gene CYC1 e igual para o gene SUC2 quando comparada com a cepa selvagem W303. A atividade de Invertase apresenta-se significativamente diminuída na cepa pkc1 ∆ quando comparada com a cepa selvagem W303. Nossos resultados confirmam a participação da proteína Pkc1p na regulação da expressão gênica durante o processo de desrepressão metabólica.
Combination of extracts from Aristolochia cymbifera with streptomycin as a potential antibacterial drug.
(2013) Silva Júnior, Willer Ferreira da; Cecílio, Samyra Giarola; Magalhães, Cíntia Lopes de Brito; Ferreira, Jaqueline Maria Siqueira; Tótola, Antônio Helvécio; Magalhães, José Carlos de
The appearance of new antibiotic-resistant bacteria is a societal problem that requires the development of new alternative treatments. Therefore, this work evaluated the antibacterial activity of ethanolic (EHI), dichloromethanic (EDI) and hexanic (EHE) extracts from Aristolochia cymbifera stems and the combination of these extracts with an antimicrobial drug to develop a new antibacterial therapy. The EDI, EHE and EHI extracts were obtained by maceration using three different solvents. The minimal inhibitory concentrations (MIC) of these extracts were determined using the microdilution test to determine the antibacterial potential of these extracts and their combination with streptomycin against Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Klebsiella pneumoniae and Shigella flexneri. The extract dose leading to the cytotoxicity of 50% of the cells (CC50) was evaluated using mammalian cells MA104 and the 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) colorimetric assay. The extracts had a MIC under 500 mg/L and a CC50 lower than 50 mg/L. The antibiotic/extract proportion influenced the antibacterial activity of the mixtures, and the proportion that optimized the antibacterial activity of streptomycin was a mixture that contained 75 percent of extract. This composition included less than 6.5 mg/L of extract and 2.5 mg/L of streptomycin and has potential as a new antibacterial therapy.
Desenvolvimento de biossensor para detecção direta de Flavivirus utilizando nanobastões de ouro.
(2019) Ribeiro, Erica Milena de Castro; Silva, Breno de Mello; Silva, Breno de Mello; Tótola, Antônio Helvécio; Figueiredo, Rute Cunha; Paula, Sérgio Oliveira de; Mosqueira, Vanessa Carla Furtado
A co-circulação de Dengue virus, Zika virus, Yellow fever virus, Chikungunia virus e Mayaro virus tem causado grande impacto na saúde pública brasileira e mundial. Os programas de controle e prevenção de arboviroses e estudos epidemiológicos poderiam ser muito beneficiados e aperfeiçoados com a utilização de metodologias de detecção direta dos vírus em mosquitos, pois possibilitaria uma vigilância mais precisa nas populações de vetores ao longo do tempo. Porém, os métodos de diagnósticos hoje disponíveis, apesar de possuírem alta sensibilidade e especificidade são, em sua maioria, onerosos, demandam treinamento específico para aplicação e interpretação e não provem um diagnóstico rápido. Neste contexto, o desenvolvimento de novas tecnologias de biossensores que apresentem benefícios quanto ao tempo de análise, sensibilidade e simplicidade de manipulação têm sido objeto de pesquisa nas esferas pública e privada. A partir deste fato, este trabalho propõe desenvolver e analisar a eficácia de metodologias de funcionalização de nanobastões de ouro (NBs) com anticorpos específicos anti-DENV2 e anti-flavivirus para testar a capacidade de detecção de ligação anticorpo-partícula viral. A detecção de biomoléculas ligadas às nanopartículas de ouro (AuNPs), tais como proteínas e anticorpos, pode ser feita a partir da análise do seu espectro de absorção. Para isso, nanobastões de ouro foram sintetizados, funcionalizados a 4 mM de polietilenoimina, conjugados a 0,4 μg/mL de anticorpos e incubados com 103 UFP/mL de vírus. Os dados foram obtidos através da leitura da ressonância plasmônica de superfície localizada em espectrômetro de varredura UV-Vis. A síntese dos nanobastões, que utilizou o método de crescimento com sementes com a utilização de diferentes agentes redutores, mostrou-se reprodutível. Além disso, um deslocamento muito expressivo no pico de absorção foi observado quando biossensores contendo anti-flavivirus foram incubados em solução com DENV2 e ZIKV, mas não foi observado após incubação com MAYV, um Alphavirus utilizado como controle negativo. Como esperado, nos biossensores contendo anti-DENV2 o deslocamento foi observado apenas na presença de DENV2, demonstrando a especificidade dos anticorpos utilizados. Na presença de soro humano diluído 1:3200 e macerado de mosquito diluído 8x, contendo DENV2 ou ZIKV, o limite de detecção estimado foi de 100 UFP/mL. Assim, sugere-se que os nanobastões de ouro apresentam potencial para o desenvolvimento de novas metodologias de diagnóstico mais rápidos, precisos e práticos que as técnicas já existentes e viabilizar estudos de vigilância da virologia em mosquitos.
Methanol extract and N,N-dimethyltryptamine from psychotria viridis ruiz & pav. inhibit in vitro the Zika virus infection.
(2021) Moraes, Thaís de Fátima Silva; Ferraz, Ariane Coelho; Nizer, Waleska Stephanie da Cruz; Tótola, Antônio Helvécio; Soares, Débora Barbosa da Silva; Duarte, Lucienir Pains; Vieira Filho, Sidney Augusto; Magalhães, Cíntia Lopes de Brito; Magalhães, José Carlos de
Zika virus (ZIKV) is a public health problem due to its association with serious fetal and neurological complications and the lack of antiviral agents and licensed vaccines against this virus. Surveillance studies have alerted about the potential occurrence of a new South American epidemic episode due to the recent circulation of an African ZIKV strain detected in Brazil. Therefore, it is essential to discover antiviral agents, including natural substances, that are capable of neutralizing the action of ZIKV. Several Psychotria species have antimicrobial and anti-infammatory properties. Thus, a methanol extract and dimethyltryptamine from Psychotria viridis were evaluated for their ability to inhibit ZIKV infection in vitro by measur- ing the efective concentration that protects 50% of cells and investigating their possible mechanisms of action. The tested samples showed antiviral activity against ZIKV. The extract showed virucidal activity, afecting viral and non-cellular ele- ments, inactivating the virus before infection or when it becomes extracellular after the second cycle of infection. It was also observed that both extract and dimethyltryptamine could inhibit the virus at intracellular stages of the viral cycle. In addition to dimethyltryptamine, it is believed that other compounds also contribute to the promising virucidal efect observed for the methanol extract. To our knowledge, this is the frst report of the activity of a methanolic extract and dimethyltryptamine from Psychotria viridis against cellular ZIKV infection. These two samples, extracted from natural sources, are potential candidates for use as antiviral drugs to inhibit ZIKV infections.
Protective effect of ions against cell death induced by acid stress in Saccharomyces.
(2009) Sant'Ana, Gilzeane dos Santos; Paes, Lisvane da Silva; Paiva, Argentino F. Vieira; Fietto, Luciano Gomes; Tótola, Antônio Helvécio; Trópia, Maria José Magalhães; Lemos, Denise da Silveira; Lucas, Cândida Manuel Ribeiro Simões; Fietto, Juliana Lopes Rangel; Brandão, Rogélio Lopes; Castro, Ieso de Miranda
Saccharomyces boulardii is a probiotic used to prevent or treat antibiotic-induced gastrointestinal disorders and acute enteritis. For probiotics to be effective they must first be able to survive the harsh gastrointestinal environment. In this work, we show that S. boulardii displayed the greatest tolerance to simulated gastric environments compared with several Saccharomyces cerevisiae strains tested. Under these conditions, a pH 2.0 was the main factor responsible for decreased cell viability. Importantly, the addition of low concentrations of sodium chloride (NaCl) protected cells in acidic conditions more effectively than other salts. In the absence of S. boulardii mutants, the protective effects of Na1 in yeast viability in acidic conditions was tested using S. cerevisiae Na1-ATPases (ena1-4), Na1/H1 antiporter (nha1D) and Na1/H1 antiporter prevacuolar (nhx1D) null mutants, respectively. Moreover, we provide evidence suggesting that this protection is determined by the plasma membrane potential, once altered by low pH and low NaCl concentrations. Additionally, the absence or low expression/activity of Ena proteins seems to be closely related to the basal membrane potential of the cells.
Seleção de leveduras de frutos e folhas nativos do Cerrado para fabricação de cachaça e cerveja.
(2022) Oliveira, Marcos de; Brandão, Rogélio Lopes; Cunha, Aureliano Claret da; Brandão, Rogélio Lopes; Tótola, Antônio Helvécio; Fietto, Luciano Gomes; Teixeira, Mônica Cristina; Silva, Silvana de Queiroz
A cachaça é o genuíno destilado nacional. A cerveja, de origem mais tardia, tornou-se a bebida mais consumida tanto pelos brasileiros quanto pela população mundial. Ambas são bebidas derivadas de processos fermentativos, realizados pelas leveduras, microrganismos responsáveis pela fermentação alcoólica. Ademais, novas cepas têm sido estudadas e testadas objetivando a produção de bebidas com características sensoriais singulares. O Cerrado é um bioma que possui grande diversidade de plantas endêmicas e frutíferas, com características relevantes que possibilitem desenvolvimento de leveduras. O objetivo deste trabalho foi selecionar leveduras dos frutos e folhas do Cerrado Mineiro que possuíssem características importantes para produção de cachaça e cerveja. Desta forma, foram isoladas um total de 37 leveduras de 6 frutos e folhas do Cerrado mineiro com características morfológicas diferentes. Posteriormente de acordo com as respostas bioquímicas relacionadas a produção de cachaça e cerveja 4 foram selecionadas, a JUR11, JUR16, ERC10B e JEN11, nas quais todas pertencem ao mesmo gênero, Meyerozyma. Na produção da cachaça, os parâmetros fermentativos apresentados pelas leveduras não se diferenciaram estatisticamente umas das outras. Os parâmetros de teores alcoólicos, acidez volátil e metabólitos voláteis secundários estão dentro dos valores encontrados em cachaças elaboradas por meios tradicionais de produção e dentro dos parâmetros aceitos da legislação vigente (IN 13/2005). Adiante, as análises sensoriais mostraram uma aceitação acima de 58% entre os degustadores, sem diferença significativa nos atributos avaliados. Nos testes bioquímicos de seleção, foi verificado que as 4 leveduras selecionadas não foram capazes de metabolizarem maltose, característica importante para fabricação de cerveja com baixo teor alcoólico. Nesse sentido, elas foram submetidas a testes em diferentes condições fermentativas sendo estimados e quantificados os principais metabólitos voláteis relacionados ao sabor e aroma e o seu teor alcóolico produzido. A levedura ERC10B foi a selecionada para produção da cerveja produzindo cervejas do tipo zero álcool. O perfil de produção dos metabolitos secundários é compatível com as cervejas com álcool, tradicionalmente produzidas. Os resultados mostram que a presença do lúpulo pode influenciar o processo fermentativo da levedura ERC10B havendo necessidades de testes mais apurados.
Virucidal activity of proanthocyanidin against Mayaro virus.
(2019) Ferraz, Ariane Coelho; Moraes, Thaís de Fátima Silva; Nizer, Waleska Stephanie da Cruz; Santos, Michelli dos; Tótola, Antônio Helvécio; Ferreira, Jaqueline Maria Siqueira; Vieira Filho, Sidney Augusto; Rodrigues, Vanessa Gonçalves; Duarte, Lucienir Pains; Magalhães, Cíntia Lopes de Brito; Magalhães, José Carlos de
Mayaro virus (MAYV) is a sublethal arbovirus transmitted by mosquitoes with possible installation of an urban cycle in the Americas. Its infection causes disabling arthralgia, and still, there is no vaccine or treatment to it. We recently investigated nearly 600 compounds by molecular docking and identified epicatechin as a potent antiviral against MAYV. The root extract of Maytenus imbricata showed anti-MAYV activity and two isolated compounds from this plant were also evaluated in vitro. Proanthocyanidin (PAC), a dimer containing epicatechin, showed an effective concentration for 50% of the cells infected by MAYV (EC50) of 37.9 ± 2.4 μM and a selectivity index (SI) above 40. PAC showed significant virucidal activity, inhibiting 100% of the virus proliferation (7 log units), and caused moderate effect during adsorption and virus internalization stage. However, PAC was unable to block the infection when only the cells were pretreated. It was observed a reduction in virus yields when adding PAC at different moments after infection. The set of results indicates that PAC binds to viral and non-cellular elements and may inactivate the MAYV. The inactivation occurs before infection or when the virus reaches the extracellular environment from the 2nd cycle of infection that could block its progression cellto-cell or to tissues not yet infected.