Métodos de extração com partição a baixa temperatura para a determinação de marcadores biológicos de exposição ao benzeno, em urina, por UHPLC-MS/MS.

Abstract

A discussão sobre marcadores biológicos de exposição ao benzeno (MBE-Bz) vem evoluindo no Brasil e no mundo. O uso do ácido trans, trans-mucônico urinário (u-ttMA) como MBE-Bz está sendo questionado, uma vez que o mesmo pode sofrer interferências do ácido sórbico, da exposição simultânea ao tolueno e dos hidrocarbonetos policíclicos aromáticos. Recentemente, a literatura aponta para a utilização do ácido S-fenilmercaptúrico urinário (u-SPMA) como MBE mais adequado e específico ao benzeno. Neste trabalho foram desenvolvidos e validados dois novos métodos analíticos capazes de extrair e quantificar estes MBEs de amostras de urina (método A: determinação do u-SPMA e método B: determinação simultânea do u-ttMA e u-SPMA). Na etapa de preparo da amostra foi desenvolvido e validado o procedimento de extração com partição em baixa temperatura (LTPE). Esta técnica possui baixo custo operacional, utiliza pequenas quantidades de amostra e solvente, é eficiente para extração de compostos polares e apolares em diversas matrizes aquosas, além de possuir um número de etapas reduzido, o que a torna de simples operação e aumenta a frequência analítica. Com o objetivo de avaliar o procedimento de extração e clean up da amostra, as seguintes variáveis foram estudadas sistematicamente através de planejamento fatorial completo 22 com quintuplicata no ponto central: (1) volume de solvente extrator e (2) volume de HCl 6 mol.L-1 adicionado. Para os dois métodos (análise do u-SPMA e análise simultânea do u-ttMA e do u-SPMA) as seguintes condições operacionais apresentaram os melhores rendimentos de extração dos analitos das amostras de urina: 600 μL de amostra de urina, 600 μL de acetonitrila como solvente extrator, 30 μL de HCl 6 mol.L-1 e tempo de 3 horas de congelamento a -20oC. As determinações dos compostos estudados foram realizadas pela separação por cromatografia líquida de ultra alta eficiência (UHPLC) e espectrometria de massas sequencial (MS/MS), com ionização por eletronebulização (ESI). Para a construção das curvas analíticas e correções dos efeitos de matriz no processo de ionização, uma nova forma de quantificação foi proposta e validada, usando as razões entre as áreas dos picos dos analitos nos extratos e as áreas do padrão adicionado automaticamente via injetor do UHPLC, em duas corridas cromatográficas consecutivas. O procedimento desenvolvido para extração do u-ttMA foi comparado com o método extração em fase sólida (SPE) com cartucho contendo trocador iônico forte (SAX). Os métodos usando LTPE e UHPLC/MS/MS foram validados, apresentando linearidade nas faixas de trabalho (R2 > 0,999), precisão (coeficientes de variação menor do que 7,0%), exatidão (94,1 e 112,0 %) e sensibilidade adequadas. Os limites de detecção dos métodos (MLOD) para determinação do u-SPMA e determinação simultânea do u-SPMA e u-ttMA foram de 0,02 e 0,01 μg.L-1 e os limites de quantificação dos métodos (MLOQ) foram de 0,084 e 0,035 μg.L-1, respectivamente. Para o u-ttMA, utilizando LTPE, o MLOD foi de 0,9 μg.L-1 e o MLOQ foi de 2,7 μg.L-1, valores cerca de duas vezes menores do que os encontrados para SPE-SAX. Os métodos foram aplicados em análises de 52 amostras de urina de indivíduos não expostos ocupacionalmente ao benzeno na qual foi evidenciada diferença estatística significativa entre fumantes e não fumantes com 95% de confiança. O valor de correlação entre concentrações do u-ttMA e do u-SPMA, ρ entre 0,14 a 0,28, está de acordo com os dados descritos na literatura.