Estudo sobre as vias de sinalização em Aspergillus fumigatus envolvidas na síntese de melanina.

Abstract

Todos os organismos necessitam de mecanismos de detecção e resposta a a nutrientes para crescimento, sobrevivência, adaptação e reprodução. Fungos patogênicos oportunistas, tais como Aspergillus fumigatus necessitam destes mecanismos para detectar e absorver os nutrientes disponíveis no hospedeiro. A capacidade de detectar os nutrientes disponíveis depende, dentre outros, da presença de proteínas transmembranares tais como os receptores acoplados a proteína G (GPCRs). Estes receptores transmitem sinais extracelulares para o ambiente intracelular. Esta transmissão ocorre a partir da ativação de vias de sinalização que podem estar ainda envolvidas na produção de importantes fatores de patogenicidade, tais como, moléculas que compõem e mantêm a integridade da parede celular de fungos (quitinas, β-1,3 glucano e manoproteinas) e a produção de pigmentos (DHN-melanina). A melanina é um pigmento que desempenha uma importante função na patogênese deste fungo, pois, confere proteção contra raios UV, da radiação solar, dessecação, lise enzimática, estresse oxidativo entre outros. Inicialmente foram descritos quinze putativos GPCRs em A. fumigatus, contudo, apenas poucos destes receptores foram caracterizados. Assim sendo, o objetivo do presente trabalho foi estudar as vias de sinalização em Aspergillus fumigatus envolvidas na síntese de melanina e na integridade da parede celular. Para tanto, os genes de três GPCRs (gprH, D e M) e os três das Gα (gpaA, B e C). foram sintetizados, subclonados nos plasmídeos da técnica do ensaio do split-ubiquitin, pTMBV4 e pDL2XN, respectivamente e expressos em Saccharomyces cerevisiae (cepa NMY32), visando identificar possíveis interações proteicas entre os Gα e os GPCRs. Este ensaio resultou na seleção da interação entre o GprM e a Gα A (GpaA). Um estudo anterior do Laboratório de Biologia Molecular-LBM observou que a cepa mutante ΔgpaA apresenta uma notável produção de melanina. Assim sendo, um screening realizado para produção de melanina com a coleção de mutantes nulos de GPCRs do LBM selecionou o mutante ΔgprM. Dados de RTqPCR mostraram elevação na expressão de um importante gene para produção de melanina (o pksP). E além disso, testes de sensibilidade ao estresse de parede celular mostraram que este mutante também é mais sensível a este estresse que a cepa selvagem. Estes dados sugerem um potencial envolvimento do GprM em vias de biossíntese de melanina em A. fumigatus.