Produção e análise de partículas sub-micrométricas poliméricas em modelo murino com potencial aplicação em vacinas anti-Leishmania.

Abstract

A leishmaniose visceral é causada pela Leishmania chagasi (sinonímia Leishmania infantum) e para se evitar a transmissão da doença, o desenvolvimento da vacina anti-leishmaniose visceral canina (LVC) é considerada a principal estratégia racional. Neste contexto, diferentes estudos propõem que seria possível um incremento na imunogenicidade vacinal anti-Leishmania ao se realizar o encapsulamento do antígeno. O objetivo deste estudo foi produzir partículas sub-micrométricas (SMP), com potencial para encapsular antígenos candidatos contra Leishmania em modelo murino e analisar o perfil inflamatório e toxicidade. Neste contexto foi realizada a produção de partículas a partir da reação entre a fase oleosa, contendo diferentes concentrações de Ácido Polilático (PLA) e acetona, e a fase aquosa, contendo diferentes concentrações de quitosana, antígeno de Leishmania braziliensis e água. Após evaporação do solvente, o tamanho das partículas foi analisado por espectroscopia de correlação de fótons, após diluição das amostras em água ultra-pura. O tamanho das SMPs obtidas variou entre 200nm e 1200μm, demonstrando variação dependente da concentração dos constituintes utilizados. Além disso, foi obtido potencial zeta variando entre +57,0 e +71,6, apresentando 64% de eficiência de encapsulamento antigênico, o que demonstrou a elevada plasticidade dos materiais usados na produção das partículas. Desta maneira, foi realizada análise da toxicidade e perfil inflamatório. Nesta etapa, foram analisados três grupos (n=5/tempo) de camundongos BALB/c, que foram acompanhados por até 72 horas após o inóculo intradérmico. Vale destacar que os diferentes inóculos foram realizados na região dorso-lombar, em volume de 100L, sendo avaliados os seguintes grupos experimentais: (i) grupo controle (C) inoculado com de solução salina estéril 0,85%, (ii) grupo partícula branca 1 (PB1) composto pelo inóculo correspondente a solução de SMP capazes de encapsular 60μg de antígeno de L. braziliensis, medindo em torno de 800nm, e, (iii) grupo partícula branca 2 (PB2) composto pelo inóculo correspondente a solução de SMP capazes de encapsular 60μg de antígeno de L. braziliensis, medindo em torno de 400nm. As análises, após os diferentes inóculos, foram realizadas em cinco tempos distintos (1/6/24/48/72 horas). Assim, após cada um dos tempos os animais foram submetidos a eutanásia para coleta de material biológico. Neste sentido, o soro foi coletado antes e após 72 horas dos diferentes inóculos para análise da função hepática (ALT, AST) e renal (ureia e creatinina). Além disto, após os diferentes tempos avaliados, um fragmento de pele da região do inóculo foi destinado a histopatologia, análise de ativação celular por NAG e MPO, e dosagem de citocinas. Não foram observadas alterações locais (nódulo ou ulceração), clínicas e comportamentais, bem como na função hepática e renal. Em relação as análises histopatológicas, a cinética inflamatória revelou infiltrado polimorfonuclear moderado no grupo C, com redução da inflamação local, em 24 horas. Para as PB1 e PB2, após 48 horas do inóculo, foi observado um infiltrado polimorfonuclear variando de moderado a intenso, com hiperemia, macrófagos e linfócitos distribuídos em toda a derme. Após 72 horas do inóculo houve resolução da inflamação no grupo PB1. Por outro lado, o grupo PB2 apresentou manutenção do infiltrado inflamatório, com redução de polimorfonucleares e aumento de células mononucleares, confirmados pela análise dos níveis NAG e MPO (macrófagos e neutrófilos, respectivamente) e presença das citocinas IL-6 e TNF-α. Diante do exposto, neste estudo foi possível concluir que ambas as PSM avaliadas (PB1 e PB2) são potenciais indutoras de inflamação local, sem causar alterações locais e sistêmicas aos animais. Deste modo, estas partículas poderiam ser utilizadas em formulações vacinais anti-Leishmania apresentando a vantagem de desencadear reação inflamatória local (efeito adjuvante), além de serem capazes de encapsular antígenos de L. braziliensis.