Regulação do transporte de lactose em Kluyveromyces lactis JA6.

Abstract

Kluyveromyces lactis é uma levedura capaz de fermentar a lactose e por isso é considerada como modelo alternativo para estudos bioquímicos, fisiológicos e genéticos de leveduras não Saccharomyces. Compreender os mecanismos de captação de lactose e a regulação envolvida no transporte é um passo importante para melhores aplicações biotecnológicas destas células. O transporte de lactose, em K. lactis é mediado por uma permease da membrana, codificada pelo gene LAC12. Nesse estudo as estirpes utilizadas foram a K. lactis JA6 e a K. lactis JA6 LAC12-GFP. As células foram cultivadas em meio YNB completo, suplementado com diferentes fontes de carbono (lactose, galactose, glicose e glicerol (3% w/w)) a uma concentração de 2% (w / v), em uma incubadora orbital a 30 ° C. As células foram colhidas no meio de fase exponencial, lavadas por três vezes com água fria, resuspensas em 100 mM Tris / tampão de citrato, pH 5.0 para medições de transporte de [D-glucose-1-14C] lactose. A cinética da taxa inicial de captação de [D-glucose-1-14] lactose foi investigada numa gama de concentrações de 0,025 a 10 mM de lactose. Galactose foi testada como inibidor competitivo do transporte de lactose, uma vez que em K. lactis Lac12p também foi descrito como transportador de galactose. Para estudar o efeito da glicose no transporte de lactose, as células foram cultivadas em lactose e divididas em duas alíquotas (controlo e 100 mM de glicose adicionada). As células foram colhidas, lavadas e a captação inicial de lactose foi medida. A taxa de captação inicial de [D-glucose-1-14C] lactose também foi investigada em células cultivadas em glicose e transferidas para lactose na presença / ausência de cicloheximida ou Higromicina B. A localização do transportador Lac12-GFP foi investigada em células crescidas em glicose e em células transferidas para lactose, ou galactose, ou glicerol. O perfil de consumo de açúcares por células de K.lactis foi analisado através de HPLC. Os resultados mostraram que o transporte de lactose em células cultivadas em 2% de lactose obedece a uma cinética de saturação. A constante de afinidade (Ks) foi de 1,49 ± 0,38 mM e a velocidade máxima (Vmáx) foi 953,47 ± 116,24 μmoles.h-1.g-1. O mesmo sistema de transporte estava presente em células cultivadas em galactose e glicerol. As células cultivadas em 2% (w/v) de glicose transportaram a lactose em taxas muito baixas. No entanto, quando as células crescidas em glicose foram transferidas para 2% (w/v) de lactose, o transporte exibe recuperação parcial. Esta recuperação não parece requerer a síntese de proteínas uma vez que cicloheximida e higromicina B não impediram a desrepressão parcial. Além disso, o transporte de lactose não é inativado pela glicose. A localização sub celular do transportador Lac12 é dependente da fonte de carbono e da sua concentração. O consumo de glicose e lactose é simultâneo apesar da glicose retardar o consumo da lactose. O consumo de lactose é preferencial ao de galactose quando os dois açúcares estão presentes simultaneamente. Estes dados nos permitem inferir que o sistema de transporte de lactose em K. lactis JA6 é constitutivo e que a glicose exerce um controle não muito claro no transporte lactose. Provavelmente, este controle envolve mecanismos transcricionais e postranscricional.