Análise do perfil de expressão de subunidades constituintes do proteassoma 26s em fases larvais e adultas do Schistosoma mansoni.

Abstract

Análises pós genômicas têm propiciado avanços significativos sobre a biologia do parasito Schistosoma mansoni. Particularmente, experimentos de transcrissômica em larga escala apontaram genes essenciais, ligados a vias de degradação proteica intracelular, com expressão diferencial ao longo do ciclo de vida do parasito. Tais achados corroboram com as marcantes alterações fenotípicas observadas após a penetração no hospedeiro vertebrado e o extenso remodelamento corporal necessário para a instalação e maturação do verme adulto no sistema porta-hepático.A presente investigação objetivou determinar o perfil de expressão de subunidades constituintes do proteassoma 26S, em fases larvais e adultas do verme. Neste intuito, oligonucleotídeos específicos para amplificação parcial das subunidades Rpn10 e alfa 7 foram confeccionados. Após a extração de RNA total de vermes adultos seguido de RT-PCR, observou-se amplificação de produtos de aproximadamente 251 e 753 pb, de massas moleculares esperadas para os amplicons relacionados às subunidades Rpn10 e alfa 7, respectivamente. Os produtos de amplificação foram purificados do gel e clonados utilizando o sistema Gateway®. Novos ciclos de amplificação demonstraram a obtenção de plasmídeos recombinantes para as duas subunidades. Entretanto, experimentos de expressão heteróloga em bactérias BL21 não permitiram a detecção epurificação das subunidades alfa 7 e Rpn10 recombinantes no lisado celular. Como proposta alternativa, utilizou-se o plasmídeo PET28a® recombinante contendo a região codificadora da subunidade Rpn10 de S. mansoni, gentilmente cedido pela Dra. Enyara Rezende Morais (Laboratório de Biologia Molecular de Parasitos - Universidade de São Paulo). Após transformação em BL21, seleção de clones recombinantes e indução com IPTG, análises por SDS-PAGE e coloração do gel por Coomassie revelaram a expressão de uma proteína recombinante de massa molecular em torno de 55 kDa. Uma preparação de Rpn10 em alto grau de homogeneidade foi obtida após purificação por afinidade em resina de níquel. Anticorpos policlonais anti-SmRpn10 recombinante foram gerados em camundongos Swiss e utilizados para avaliação do perfil de expressão de Rpn10 em extratos solúveis de cercárias, esquistossômulos (de 3h e 3 dias), vermes adultos, ovos e miracídios. A partir de eletroforese bidimensional, utilizando separação isoelétrica em gel de gradiente linear (pH 3-10) e Western blotting, foram detectadas 3 isoformas para Rpn10 em todos os estágios investigados. Essas apresentaram aumento de expressão no estágio de cercária, o qual foi novamente confirmado por Western blotting 1D comparando as fases analisadas. Este achado refere-se ao primeiro relato da existência de isoformas para a subunidade Rpn10 constituinte do proteassoma 26S e agrega diversidade ao perfil de subpopulações possíveis e alternativas deste complexo proteolítico em S. mansoni