E-NTPDase-2 de Leishmania amazonensis é importante na adesão do parasito ao macrófago e participa da modulação da resposta inflamatória, de forma dependente e independente da atividade ectonucleotidás.

Abstract

As NTPDases (nucleosídeo trisfosfato difosfohidrolases) são enzimas com a habilidade de hidrolisar nucleotídeos di e trifosfatados sob estímulo de íons bivalentes (Ca2+ ou Mg2+). São encontradas em diversos tipos celulares, incluindo protozoários, como parasitos do gênero Leishmania. Dada a relação entre a expressão e a atividade de Ecto-NTPDase de L. amazonensis e a capacidade do parasito em causar lesão em camundongos, decidimos investigar os mecanismos pelos quais essa enzima participa da infecção em macrófagos, a principal célula hospedeira para Leishmania. Primeiramente investigamos o papel da expressão dessa enzima na adesão à célula hospedeira. Observamos que promastigotas metacílicas que possuem alta expressão de E-NTPDase-2 aderem mais à células J774. A inibição da expressão dessa enzima por cultivo em meio suplementado com adenina reduz a adesão e internalização dos parasitos. Demonstramos, ainda, que o bloqueio da enzima por anticorpo antiNTPDase-2 de Leishmania resulta numa redução da adesão e internalização dos parasitos. Em formas amastigotas, por outro lado, a atividade e expressão da enzima é bastante reduzida e não parece ter nenhum efeito sob a infecção dessas formas. Tendo comprovado o papel da E-NTPDase-2 na adesão e internalização de L. amazonensis na célula hospedeira, objetivamos identificar o receptor de macrófagos envolvido nesse processo. Resultados anteriores levantaram a hipótese que o CR3 estaria envolvido nessa ligação. O bloqueio desse receptor com anticorpo anti-CD11b foi capaz de reduzir drasticamente a ligação e internalização de NTPDase recombinante, como demonstrado por microscopia confocal. Decidimos ainda investigar se a presença da enzima interfere com a sobrevivência do parasito em macrófagos estimulados por IFN-e LPS. Observamos que parasitos de alta atividade e expressão de E-NTPDase-2 sobrevivem mais em células ativadas, por reduzirem a produção de NO por essas células. A inibição da atividade ectonucleotidásica dos parasitos da cepa PH8, por incubação dos parasitos com DIDS, reduz a capacidade de L. amazonensis de modular a produção de NO e sobreviver em macrófagos estimulados. Além disso, a infecção por L. amazonensis reduz a produção de citocinas inflamatórias TNF-α e IL-12. Essa modulação é revertida em parasitos tratados com DIDS. Para investigar se a adenosina é responsável pela inibição da resposta inflamatória, a infecção foi realizada na presença de antagonistas específicos dos receptores de adenosina A2A ou A2B. O bloqueio dos receptores A2B reduziu a sobrevivência do parasito no interior das células estimuladas. Isso está associado com um aumento na produção de NO, IL-12 e TNF-α. Tomados em conjunto, estes resultados mostram que a atividade de E-NTPDase-2 em L. amazonensis é importante para a geração de substrato para a produção de adenosina que, ao atuar sobre os receptores A2B, reduz a produção de IL-12 e TNF-α, citocinas que são essenciais para a produção de NO pelas células estimuladas, favorecendo a infecção. Por fim, para investigar se a enzima teria um papel direto na modulação da resposta imune, tratamos macrófagos com rNTPDase de Leishmania por 3 horas. As células foram lavadas e estimuladas por 48 horas na presença de IFN-e LPS. Observamos que mesmo na ausência de atividade ectonucleotidásica, a enzima recombinante é capaz de modular a produção de NO, IL-12 e TNF-α. A inibição da atividade por DIDS ou o bloqueio dos receptores de adenosina não impede que a rNTPDase tenha um efeito imunomodulador. Mais ainda, demonstramos que quando o CD11b das células foi bloqueado por anticorpo específico, a rNTPDase perdeu a capacidade em modular a resposta inflamatória. Em síntese, demonstramos que a E-NTPDase-2 de L. amazonensis é importante na adesão do parasito à células hospedeira pela ligação ao receptor CD11b e reduz a produção de NO e citocinas inflamatórias de maneira dependente e independente da atividade ectonucleotidásica.