Análise bioquímica inicial do proteassoma em populações do Trypanosoma cruzi com diferentes fenótipos de resistência ao benzonidazol.

Abstract

Diferenças na susceptibilidade ao benzonidazol (Bz) e nifurtimox (NFX) entre as populações do Trypanosoma cruzi podem explicar, pelo menos em parte, as diferenças na eficácia do tratamento da Doença de Chagas. O proteassoma tem um papel importante na degradação de proteínas normais, danificadas, mutadas, ou desnaturadas, incluindo a degradação de proteínas reguladoras das diversas vias celulares, tais como ciclo celular e apoptose e proteínas danificadas em resposta ao estresse. Este trabalho teve como objetivo geral analisar se o perfil de expressão e a taxa de proteólise intracelular dependente de proteassoma são afetados pelo fenótipo de resistência às drogas. Para isso, foram utilizadas populações de T. cruzi com o mesmo genótipo e resistência induzida in vitro (17WTS / 17LER) e in vivo (BZS / BZR), bem como diferentes genótipos, uma população susceptível (CL) e outra naturalmente resistente (Colombiana) ao benzonidazol. Inicialmente os níveis do proteassoma 20S, proteassoma símile HslV, PA700 e a PA26 foram avaliados por Western blot. Os resultados obtidos mostraram que não há efeito do fenótipo das cepas sobre a quantidade relativa tanto do proteassoma 20S, HslV, como dos seus reguladores. Posteriormente, as atividades peptidásicas do proteassoma 20S foram avaliadas utilizando-se substratos fluorogênicos. Foram observadas variações significativas na atividade semelhante à quimotripsina, tripsina, e caspase do proteassoma, sendo que somente a atividade semelhante à tripsina mostrou-se correlacionar com o fenótipo de resistência ao benzonidazol. Finalmente foi avaliada a taxa de proteólise intracelular nas mesmas populações, na presença de ATP, ATP e ubiquitina e ATP, ubiquitina e MG132, um inibidor clássico do proteassoma 20 e 26S. Os resultados obtidos sugerem que a adição de ubiquitina não induziu um aumento real na taxa de proteólise, além disso, observou-se um aumento real na proteólise após 90 minutos de indução na presença de ATP, sugerindo a coexistência de mecanismos de proteólise dependente de proteassoma e independente de ubiquitina. Para corroborar essa hipótese, foram avaliados os níveis de proteínas oxidadas e ubiquitinadas. Os resultados sugerem um perfil similar de proteína ubiquitinadas e diferencial para as oxidadas. Em conjunto, os resultados obtidos nesse trabalho sugerem que o steady state protéico em epimastigota é influenciado pela resistência a droga. Futuros experimentos serão realizados para determinar quais proteínas são os alvos naturais desta via metabólica.