Navegando por Autor "Siqueira, Filipe da Silva"

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Bioprospecção de leveduras oleaginosas capazes de utilizar o glicerol bruto como fonte de carbono.
(2015) Siqueira, Filipe da Silva; Brandão, Rogélio Lopes
Os biocombustíveis, bioetanol e biodiesel, estão entre as fontes de energia alternativas promissoras para reduzir a utilização dos combustíveis fósseis. O biodiesel é um éster metílico ou etílico obtido a partir da transesterificação de óleos vegetais na presença de um álcool. Esta reação gera como subproduto, o glicerol bruto (GB), que equivale a 10% de todo volume gerado. Uma alternativa para o consumo do GB é a sua utilização como fonte de carbono por micro-organismos oleaginosos. Os óleos estocados podem ser utilizados como uma fonte alternativa de óleos para produção do biodiesel. Os micro-organismos oleaginosos são capazes de acumular mais de 20% de sua biomassa em lipídeos e seus óleos apresentam estrutura química semelhante aos óleos vegetais. Portanto, o objetivo deste trabalho foi selecionar leveduras capazes de metabolizar o glicerol bruto e estocá-lo na forma de lipídeos. Sessenta e três isolados de leveduras oriundas da produção de cachaça foram avaliados quanto à capacidade de crescer na presença de GB, como única fonte de carbono, e armazená-lo na forma de lipídeos. As leveduras foram inoculadas em meio mínimo Synthetic Defined (SD) contendo 10% de GB e incubadas a 23°C, durante um período de 48 horas. No ensaio colorimétrico com Sudan Black (corante lipofílico) as culturas foram fixadas em lâminas e analisadas em microscópio óptico. Vinte e cinco cepas foram selecionadas como leveduras capazes de armazenar lipídeos. Posteriormente, estas cepas foram submetidas a ensaio quantitativo utilizando o corante fluorescente Nile Red. Para isso, foram inoculadas em meio SD com 10% de GB, incubadas a 28°C, sob agitação de 180 RPM, por 48 horas e colocadas em solução Nile Red 0,1 mg/mL por 10 minutos. Seis leveduras apresentaram o dobro da acumulação de lipídeo em comparação a Yarrowia lipolytica (controle positivo). Estas cepas foram posteriormente submetidas à caracterização dos ácidos graxos produzidos, na cromatografia gasosa-Flame Ionization Detector (CG-FID). A cepa LBCM3 apresentou o maior conteúdo lipídico dentre as selecionadas com 36,60% de lipídeos. Além disso, esta foi a única cepa capaz de produzir simultaneamente os ácidos linoléico e linolênico, lipídeos estes importantes para produção de biodiesel. A cepa LBCM17 apresentou o segundo maior conteúdo lipídico com 27,90% de lipídeos totais. As cepas LBCM95 e LBCM98 exibiram 21,90% e 2,17% de lipídeos totais, respectivamente. A LBCM1 apresentou o menor conteúdo lipidíco com 0,22% de lipídeos totais. Os resultados demonstram que as leveduras selecionadas são capazes de utilizar o GB como fonte de carbono e possuem potencial para aplicação na produção de biodiesel. As seis leveduras selecionadas na análise semi-quantitativa, segundo resultado do sequenciamento da região ITS5.8s, são Saccharomyces cerevisiae.
Estudo sobre as vias de sinalização em Aspergillus fumigatus envolvidas na síntese de melanina.
(2019) Siqueira, Filipe da Silva; Goldman, Gustavo Henrique; Goldman, Gustavo Henrique; Correa Junior, Ary; Silva, Breno de Mello; Zama, Uyrá dos Santos; Santos, Vera Lucia dos
Todos os organismos necessitam de mecanismos de detecção e resposta a a nutrientes para crescimento, sobrevivência, adaptação e reprodução. Fungos patogênicos oportunistas, tais como Aspergillus fumigatus necessitam destes mecanismos para detectar e absorver os nutrientes disponíveis no hospedeiro. A capacidade de detectar os nutrientes disponíveis depende, dentre outros, da presença de proteínas transmembranares tais como os receptores acoplados a proteína G (GPCRs). Estes receptores transmitem sinais extracelulares para o ambiente intracelular. Esta transmissão ocorre a partir da ativação de vias de sinalização que podem estar ainda envolvidas na produção de importantes fatores de patogenicidade, tais como, moléculas que compõem e mantêm a integridade da parede celular de fungos (quitinas, β-1,3 glucano e manoproteinas) e a produção de pigmentos (DHN-melanina). A melanina é um pigmento que desempenha uma importante função na patogênese deste fungo, pois, confere proteção contra raios UV, da radiação solar, dessecação, lise enzimática, estresse oxidativo entre outros. Inicialmente foram descritos quinze putativos GPCRs em A. fumigatus, contudo, apenas poucos destes receptores foram caracterizados. Assim sendo, o objetivo do presente trabalho foi estudar as vias de sinalização em Aspergillus fumigatus envolvidas na síntese de melanina e na integridade da parede celular. Para tanto, os genes de três GPCRs (gprH, D e M) e os três das Gα (gpaA, B e C). foram sintetizados, subclonados nos plasmídeos da técnica do ensaio do split-ubiquitin, pTMBV4 e pDL2XN, respectivamente e expressos em Saccharomyces cerevisiae (cepa NMY32), visando identificar possíveis interações proteicas entre os Gα e os GPCRs. Este ensaio resultou na seleção da interação entre o GprM e a Gα A (GpaA). Um estudo anterior do Laboratório de Biologia Molecular-LBM observou que a cepa mutante ΔgpaA apresenta uma notável produção de melanina. Assim sendo, um screening realizado para produção de melanina com a coleção de mutantes nulos de GPCRs do LBM selecionou o mutante ΔgprM. Dados de RTqPCR mostraram elevação na expressão de um importante gene para produção de melanina (o pksP). E além disso, testes de sensibilidade ao estresse de parede celular mostraram que este mutante também é mais sensível a este estresse que a cepa selvagem. Estes dados sugerem um potencial envolvimento do GprM em vias de biossíntese de melanina em A. fumigatus.