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Avaliação da atividade da H+-ATPase de membrana citoplasmática em cepas de Saccharomyces cerevisiae de dois backgrounds genéticos com mutações dos genes SNF3, PMC1 e/ou ARG82.
(2017) Bessa, Maria Ana Santana e Figueiredo; Brandão, Rogélio Lopes; Santos, Fernanda Godoy; Brandão, Rogélio Lopes; Andrade, Milton Hércules Guerra de; Fietto, Luciano Gomes
A H+-ATPase de membrana plasmática, codificada pelo gene PMA1, é responsável pela formação de um gradiente eletroquímico de prótons que possibilita o controle do pH intracelular e a captação de nutrientes pela célula. A Pma1p é ativada na presença de glicose e várias proteínas estão envolvidas nesse processo, modulando de forma direta ou indireta, a atividade desta enzima. Estudos prévios, realizados em diferentes background de S. cerevisiae, correlacionaram vários genes envolvidos na atividade da Pma1p, mas ainda não foi elucidado o papel de cada um deles nesta via de ativação, bem como a relação deles em cada background estudado. No presente trabalho foi realizada a construção de múltiplos mutantes para os genes PMC1, SNF3 e ARG82 em dois diferentes background de S. cerevisiae (BY4741 e PJ69) a fim de ampliar o conhecimento dos mecanismos envolvidos na via de sinalização da ativação da H+-ATPase mediada por glicose. Para isso, foram realizados procedimentos de acidificação celular do meio, determinação da disponibilidade de cálcio intracelular e avaliação da sensibilidade ao antibiótico higromicina B e ao alumínio. Os resultados do presente trabalho confirmaram a importância dos genes ARG82, PMC1 e SNF3 na regulação da atividade da H+-ATPase de membrana citoplasmática, em S. cerevisiae. Foram verificadas variações na disponibilidade de cálcio citosólico e na atividade de Pma1p entre os mutantes construídos. Aparentemente, a proteína Arg82p, dentre as três proteínas estudadas neste trabalho, possui um papel mais importante na ativação da enzima Pma1p, seja na: (i) modulação do cálcio intracelular, (ii) na acidificação do meio, (iii) na sensibilidade à higromicina e ao alumínio, e (iv) na capacidade fermentativa das células. Contudo, apesar da importância do cálcio como regulador intracelular na atividade de Pma1p, não foi verificada uma relação direta entre a concentração de cálcio citosólico e a atividade de Pma1p sugerindo que outros fatores possam estar envolvidos. Ademais, os diferentes resultados encontrados, nos diferentes backgrounds, demonstraram que o efeito das mutações poderia ser dependente da linhagem analisada.
Draft genome sequence of Wickerhamomyces anomalus LBCM1105, isolated from cachaça fermentation.
(2020) Cunha, Aureliano Claret da; Santos, Renato Augusto Corrêa dos; Pachón, Diego Mauricio Riaño; Squina, Fábio Márcio; Oliveira, Juliana Velasco de Castro; Goldman, Gustavo Henrique; Souza, Aline Tieppo de; Gomes, Lorena Soares; Santos, Fernanda Godoy; Teixeira, Janaina Aparecida; Oliveira, Fábio Faria; Cruz, Izinara Rosse da; Castro, Ieso de Miranda; Lucas, Cândida; Brandão, Rogélio Lopes
Wickerhamomyces anomalus LBCM1105 is a yeast isolated from cachaça distillery fermentation vats, notable for exceptional glycerol consumption ability. We report its draft genome with 20.5x in-depth coverage and around 90% extension and completeness. It harbors the sequences of proteins involved in glycerol transport and metabolism.
Estudos sobre consumo de glicerol por leveduras para fins biotecnológicos.
(2019) Cunha, Aureliano Claret da; Brandão, Rogélio Lopes; Santos, Fernanda Godoy; Lucas, Cândida Manuel Ribeiro Simões; Brandão, Rogélio Lopes; Tótola, Marcos Rogério; Freitas, Renata Nascimento de; Silva, Silvana de Queiroz; Mendes, Tiago Antônio de Oliveira
Nos últimos anos o aumento do excedente de produção do glicerol bruto, um subproduto da produção do biodiesel, tem estimulado a busca por processos alternativos de aplicação do glicerol. De entre as alternativas, destacam-se os processos biotecnológicos onde o glicerol é convertido por microrganismos em um produto com maior valor agregado, de amplo uso industrial e com menor impacto ambiental. O objetivo do presente trabalho foi caracterizar Wickerhamomyces anomalus LBCM1105, uma cepa capaz de utilizar eficientemente o glicerol como única fonte de carbono, através do isolamento e caracterização do transportador de alta afinidade de glicerol (WaStl1p), e do sequenciamento do seu genoma. Estratégias de engenharia genética foram também utilizadas em Saccharomyces cerevisiae BY4741, com intuito de otimizar o consumo de glicerol e obter a sua conversão em etanol. LBCM1105 apresentou velocidades de crescimento maiores que BY4741 independente do meio (YP ou YNB) e da fonte de carbono (glicose ou glicerol). Com o objetivo de melhorar o desempenho de BY4741 em glicerol, foi tentada a sobrexpressão simultânea do transportador ativo de glicerol Stl1 e da primeira enzima da assimilação do glicerol, a glicerol quinase Gut1, com vista a aumentar o fluxo metabólico de consumo do glicerol. Adicionalmente foi também sobrexpresso o fator de transcrição/ativador Pdc2 que controla vários genes, incluindo PDC1, PDC10 e THI10, com vista a promover o desvio do fluxo glicolítico para a fermentação. Todas as construções foram confirmadas por amplificação de fragmentos alvo e sequenciamento de DNA. O desempenho final de cada mutante foi avaliado, não tendo sido obtido o efeito esperado. A taxa de crescimento foi tanto menor quanto mais modificações genéticas, sugerindo uma diminuição de fitness proporcional. Em colaboração com o Laboratório Nacional de Ciência e Tecnologia do Bioetanol (CTBE), o genoma da LBCM1105 foi sequenciado, montado, anotado e submetido a análises filogenéticas multiloci. O genoma da W. anomalus LBCM1105 apresenta 12,78 Mb, com %CG de 34,52, cobertura de 20,5x em profundidade e 90% de extensão e completude. Comparando com leveduras conhecidas, o genoma contém todas as sequências de proteínas relacionadas ao transporte e metabolismo de glicerol. O gene WaSTL1 foi isolado por PCR e clonado no vetor (pCev-G2-Km). O mutante S. cerevisiae BY4741 stl1Δ foi transformado com a construção. A caracterização do mecanismo de transporte de glicerol confirmou (i) que WaStl1p tem uma elevada afinidade para o glicerol, Km = 0,96 ± 0,15 mM, (ii) que a cepa LBCM1105 apresenta além da afinidade uma elevada quantidade de transportador ativo, Vmax = 148,3 ± 10,16 μmol·h−1·g−1, e (iii) que o gene expresso heterologamente em S. cerevisiae stl1Δ complementa o mutante. O caráter ativo do transporte foi confirmado pela sensibilidade ao protonionóforo carbonil cianeto m-clorofenilhidrazona, tanto na LBCM1105 como na S. cerevisiae stl1Δ WaSTL1. Futuros estudos das vias metabólicas de glicerol em leveduras serão necessários para que novas estratégias de engenharia genética sejam mais eficientes.
High‑affinity transport, cyanide‑resistant respiration, and ethanol production under aerobiosis underlying efficient high glycerol consumption by Wickerhamomyces anomalus.
(2019) Cunha, Aureliano Claret da; Gomes, Lorena Soares; Santos, Fernanda Godoy; Oliveira, Fábio Faria; Teixeira, Janaina Aparecida; Sampaio, Geraldo Magela Santos; Trópia, Maria José Magalhães; Castro, Ieso de Miranda; Lucas, Cândida Manuel Ribeiro Simões; Brandão, Rogélio Lopes
Wickerhamomyces anomalus strain LBCM1105 was originally isolated from the wort of cachaça (the Brazilian fermented sugarcane juice-derived Brazilian spirit) and has been shown to grow exceptionally well at high amounts of glycerol. This paramount residue from the biodiesel industry is a promising cheap carbon source for yeast biotechnology. The assessment of the physiological traits underlying the W. anomalus glycerol consumption ability in opposition to Saccharomyces cerevisiae is presented. A new WaStl1 concentrative glycerol-H+ symporter with twice the affinity of S. cerevisiae was identified. As in this yeast, WaSTL1 is repressed by glucose and derepressed/induced by glycerol but much more highly expressed. Moreover, LBCM1105 aerobically growing on glycerol was found to produce ethanol, providing a redox escape to compensate the redox imbalance at the level of cyanide-resistant respiration (CRR) and glycerol 3P shuttle. This work is critical for understanding the utilization of glycerol by non-Saccharomyces yeasts being indispensable to consider their industrial application feeding on biodiesel residue.
Identificação de genes envolvidos na tolerância ao alumínio em Saccharomyces cerevisiae.
(2022) Ferreira, Ludmila da Conceição; Cruz, Izinara Rosse da; Brandão, Rogélio Lopes; Cunha, Aureliano Claret da; Cruz, Izinara Rosse da; Brandão, Rogélio Lopes; Cunha, Aureliano Claret da; Magalhães, Cíntia Lopes de Brito; Santos, Fernanda Godoy
A produção de etanol combustível representa um importante papel na economia de vários países, sendo os Estados Unidos, Brasil e China os maiores produtores mundiais. O bioetanol é um combustível renovável, sendo o biocombustível mais consumido no Brasil. A síntese do etanol é normalmente realizada com a obtenção de uma solução de açúcares, que são fermentados para produzir etanol, sendo este separado por destilação e purificado. A principal rota metabólica envolvida na fermentação alcoólica em leveduras é a glicólise. Diversos fatores fisiológicos podem influenciar no desempenho fermentativo da Saccharomyces cerevisiae, como o estresse osmótico, o estresse ácido, a contaminação bacteriana e a presença de níveis tóxicos de alumínio. Em virtude da fermentação ocorrer em condições ácidas, o alumínio, absorvido pela cana-de-açúcar em solos ácidos, provoca sérios problemas durante a fermentação. As cepas de leveduras industriais diferem bastante em relação à tolerância ao alumínio e, considerando o potencial de aplicação biotecnológica das leveduras, se faz necessário um estudo das bases genéticas envolvidas nesse fenótipo de tolerância. Neste contexto, o objetivo do presente projeto foi identificar no genoma da Saccharomyces cerevisiae genes que possam estar envolvidos na tolerância ao alumínio. Desse modo, localizou-se os genes presentes na região do QTL no cromossomo VI apontados por Mezadri (2018), envolvidos na tolerância ao alumínio em S. cerevisiae e avaliou-se a tolerância ao alumínio por meio de testes de crescimento contendo diferentes concentrações de alumínio. Para verificar se os genes candidatos a estarem envolvidos com a tolerância ao alumínio carregavam variantes genéticas que poderiam estar associadas ao fenótipo de interesse, as sequências de nucleotídeos desses genes foram alinhadas utilizando a ferramenta online Clustal Omega, para visualização e análise do alinhamento múltiplo das sequencias de nucleotídeos utilizou-se o programa Jalview 2 e para visualização das variantes genéticas utilizou-se a ferramenta IGV. Nossos resultados indicaram envolvimento de 18 genes com a tolerância ao alumínio e três tipos variantes genéticas sendo elas sinônima, missense e sem sentido, que permitem estudo de modificação de SNV. Além disso, nossos resultados fornecem dados promissores para melhoramento de cepas industriais para produção de bioetanol.
Lpx1p links glucose-induced calcium signaling and plasma membrane H+-ATPase activation in Saccharomyces cerevisiae cells.
(2017) Castanheira, Diogo Dias; Santana, Eduardo Perovano; Santos, Fernanda Godoy; Diniz, Raphael Hermano Santos; Oliveira, Fábio Faria; Pereira, Renata Rebeca; Trópia, Maria José Magalhães; Castro, Ieso de Miranda; Brandão, Rogélio Lopes
In yeast, as in other eukaryotes, calcium plays an essential role in signaling transduction to regulate different processes. Many pieces of evidence suggest that glucose-induced activation of plasma membrane H+-ATPase, essential for yeast physiology, is related to calcium signaling. Until now, it was not identified any protein that could be regulated by calcium in this context. Lpx1p, a serine-protease that is also involved in the glucose-induced activation of the plasma membrane H+-ATPase activation, could be a candidate to respond to intracellular calcium signaling involved in this process. In this work, and by using different approaches, we showed many pieces of evidence suggesting that the requirement of calcium signaling for activation of the plasma membrane H+-ATPase is due to its requirement for activation of Lpx1p. According to the current model, activation of Lpx1p would cause hydrolysis of an acetylated tubulin that keeps the plasma membrane H+-ATPase in an inactive state. Therefore, after its activation, Lpx1p would hydrolyze the acetylated tubulin making the plasma membrane H+-ATPase phosphorylation accessible for at least one protein kinase.
A proteína Lpx1 como elo entre a sinalização de cálcio intracelular e a ativação de H+-ATPase de membrana citoplasmática, induzidas por glicose, em Saccharomyces cerevisiae.
(2018) Castanheira, Diogo Dias; Brandão, Rogélio Lopes; Santos, Fernanda Godoy; Diniz, Raphael Hermano Santos; Brandão, Rogélio Lopes; Ulhoa, Cirano José; Fietto, Luciano Gomes; Isoldi, Mauro César; Andrade, Milton Hércules Guerra de
Em leveduras, como em outros eucariotos, o cálcio desempenha um papel essencial nas vias de sinalização celular. No entanto, até agora, a influência do cálcio na ativação de H+-ATPase de membrana citoplasmática induzida por glicose, uma via essencial para a fisiologia de leveduras, não foi demonstrada apesar de muitas evidências sugerirem que o cálcio é um fator primordial envolvido na ativação de H+-ATPase. H+-ATPase é uma proteína de membrana citoplasmática essencial para criar um gradiente de H+, utilizado para o transporte de nutrientes e homeostase do pH. A ativação de H+-ATPase é regulada pela atividade de diferentes proteínas como proteases, quinases e canais iônicos. Neste trabalho, foi demonstrada a relação entre a atividade de Lpx1p, uma serino-protease essencial para a ativação induzida por glicose de H+-ATPase de membrana citoplasmática, e o cálcio. Mutantes lpx1Δ exibiram um sinal de cálcio intracelular que não foi afetado enquanto a atividade de bombeamento de prótons foi reduzida, indicando sua essencialidade na ativação de H+-ATPase. Além disso, o aumento da atividade de bombeamento de prótons foi observado quando Lpx1p foi expresso em células lpx1Δ por meio de um vetor de expressão induzível. Em testes in vitro, a atividade proteolítica de Lpx1p aumentou na presença de cálcio. Dos ensaios in vitro, estabelecidos neste trabalho, foi demonstrado que Lpx1p, Ptk2p e cálcio são elementos-chave para a ativação de H+- ATPase. Esses resultados fortalecem um modelo em que a ativação pós-traducional de H+-ATPase induzida pela glicose e a sinalização de cálcio intracelular, estão realmente conectadas. Lpx1p seria este elo, aparentemente, dependendo da presença de cálcio para ser ativada e hidrolisar tubulinas acetiladas ligadas à H+-ATPase, permitindo a liberação da cauda C-terminal para fosforilação e ativação.
Quality improvement and geographical indication of cachaça (Brazilian spirit) by using local selected yeast strains.
(2016) Barbosa, Edilene Alves; Souza, Magalhães Teixeira de; Diniz, Raphael Hermano Santos; Santos, Fernanda Godoy; Oliveira, Fábio Faria; Correa, Lygia Fátima da Mata; Alvarez, Florencia; Coutrim, Maurício Xavier; Afonso, Robson José de Cássia Franco; Castro, Ieso de Miranda; Brandão, Rogélio Lopes
Aims: In order to improve the quality and to create a biological basis for obtainment of the protected denomination of origin (PDO), indigenous yeast were isolated and characterized for use in Salinas city (the Brazilian region of quality cachac a production). Material and methods: Seven thousand and two hundred yeast colonies from 15 Salinas city distilleries were screened based on their fermentative behaviour and the physicochemical composition of cachac a. Molecular polymorphic analyses were performed to characterize these isolates. Results: Two Saccharomyces cerevisiae strains (nos. 678 and 680) showed appropriate characteristics to use in the cachac a production: low levels of acetaldehyde and methanol, and high ethyl lactate/ethyl acetate ratio respectively. They also presented polymorphic characteristics more closely related between themselves even when compared to other strains from Salinas. Conclusions: The application of selected yeast to cachac a production can contribute for the improvement of the quality product as well as be used as a natural marker for PDO. Significance and Impact of the Study: This study suggests that the use of selected yeast strains could contribute to obtain a cachac a similar to those produced traditionally, while getting wide acceptation in the market, yet presenting more homogeneous organoleptic characteristics, and thus contributing to the PDO implementation.