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Alteration in cellular viability, pro-inflammatory cytokines and nitric oxide production in nephrotoxicity generation by Amphotericin B : involvement of PKA pathway signaling.
(2013) França, Flávia Dayrell; Ferreira, Andrea da Fonseca; Lara, R. C.; Rossoni Júnior, Joamyr Victor; Costa, Daniela Caldeira; Moraes, Karen Cristiane Martinez de; Tagliati, Carlos Alberto; Chaves, Míriam Martins
Amphotericin B is one of the most effective antifungal agents; however, its use is often limited owing to adverse effects, especially nephrotoxicity. The purpose of this study was to evaluate the effect of inhibiting the PKA signaling pathway in nephrotoxicity using Amphotericin B from the assessment of cell viability, pro-inflammatory cytokines and nitric oxide (NO) production in LLC-PK1 and MDCK cell lines. Amphotericin B proved to be cytotoxic for both cell lines, as assessed by the mitochondrial enzyme activity (MTT) assay; caused DNA fragmentation, determined by flow cytometry using the propidium iodide (PI) dye; and activated the PKA pathway (western blot assay). In MDCK cells, the inhibition of the PKA signaling pathway (using the H89 inhibitor) caused a significant reduction in DNA fragmentation. In both cells lines the production of interleukin-6 (IL)-6 proved to be a dependent PKA pathway, whereas tumor necrosis factor-alpha (TNF-α) was not influenced by the inhibition of the PKA pathway. The NO production was increased when cells were pre-incubated with H89 followed by Amphotericin B, and this production produced a dependent PKA pathway in LLC-PK1 and MDCK cells lines. Therefore, considering the present study’s results as a whole, it can be concluded that the inhibition of the PKA signaling pathway can aid in reducing the degree of nephrotoxicity caused by Amphotericin B.
Análise da expressão de COX-2 em células H9c2 infectadas com T. cruzi cepa Berenice-62.
(2013) Monteiro, Cíntia Júnia; Moraes, Karen Cristiane Martinez de
O protozoário intracelular Trypanosoma cruzi é o agente etiológico da doença de Chagas, a principal causadora de cardiomiopatia e insuficiência cardíaca em regiões de endemicidade na América Latina. A miocardite aguda, uma das consequências da doença, é caracterizada por uma resposta inflamatória intensa com envolvimento de mediadores inflamatórios; dentre estes imunomoduladores, a prostaglandina E2 (PGE2) apresenta um importante papel no desenvolvimento da doença contribuindo para o remodelamento cardíaco e deficiências funcionais deste órgão após a infecção pelo T. cruzi. Os níveis de produção deste eicosanoide estão diretamente relacionados com a expressão e atividade da enzima ciclooxigenase-2 (COX-2). A regulação da expressão desta proteina pode se dar a nível transcricional, envolvendo a participação de fatores de transcrição, ou pós-transcricional, envolvendo proteínas que se ligam a RNAm, como a CUGBP2 e também por microRNAs. Desta forma, considerando-se que as respostas iniciais dos cardiomiócitos frente a invasão pelo T. cruzi desempenham um papel fundamental no estabelecimento da infecção a longo prazo e, assim, influenciam na progressão da doença, objetivou-se, neste estudo, avaliar a regulação e expressão de COX-2 em células H9c2 nos períodos iniciais após a infecção pela cepa Berenice-62 do T. cruzi. Para isso, foram estudados tempos de interação (período em que o parasito encontra-se no meio intracelular) de 0, 2, 6, 12, 24 e 48 horas após a infecção que foi realizada no período de 2 horas; células não infectadas foram utilizadas como controle. Foram realizadas análises da expressão dos transcritos e proteinas de COX-2, CUGBP2 e NF-kB; dos níveis de PGE2 produzidos durante a infecção; da expressão dos transcritos de Bcl-2, BAX e caspases 3 e 9, genes envolvidos na apoptose; da expressão de c-Myc, c-Jun e c-Fos (cujas proteinas se dimerizam para formarem o fator de transcrição AP1) e expressões de microRNAs envolvidos na modulação da expressão de COX-2, CUGBP2 e fosfolipase A2. Além disso, foi realizada microscopia de fluorescência para verificar a localização das proteinas COX-2, CUGBP2 e do RNAm de COX-2. Como resultados, observou-se que a infecção pela cepa Berenice-62 induz várias alterações celulares, dentre elas, o aumento da expressão e da atividade da proteina COX-2. O parasito também induz translocação desta proteina da região perinuclear para o núcleo e também para o citoplasma. Os fatores de transcrição NFkB, AP1 e c-Myc parecem não estar envolvidos na expressão de COX-2. Em relação a regulação pós-transcricional, a CUGBP2 parece regular a tradução de COX-2, porém, os miRNAs estudados não parecem estar envolvidos nesta regulação. O parasito apresenta-se co-localizado à COX-2 e à CUGBP2, levantando a hipótese do parasito se aderir a estas moléculas, ou até mesmo, internalizá-las.
Análise de elementos moduladores dos níveis da enzima COX-2 em células H9c2 infectadas com Trypanosoma cruzi; cepa Berenice-62.
(2014) Mota, Suianne Letícia Antunes; Moraes, Karen Cristiane Martinez de
A doença de Chagas, causada pelo protozoário Trypanosoma cruzi, é responsável por uma significante mortalidade e morbidade nas Américas Central e do Sul, afetando um número significativo da população mundial. A doença desenvolveu-se ao longo de décadas e a presença de mediadores inflamatórios e a hipertrofia cardíaca são características comuns. Buscando uma compreensão dos mecanismos moleculares que ocorrem no processo inflamatório e que subsidiem a caracterização de marcadores moleculares na patologia chagásica, a proteína COX-2 tornou se objeto de estudo. Sabe- se que a regulação desta proteína pode se dar a nível transcricional e/ou pós traducional, envolvendo um conjunto de fatores protéicos e incluindo a participação de miRNAs. Estudos recentes tem mostrado uma possível co-regulação indireta entre os níveis de PTEN e de COX-2, mas até o momento, os resultados preliminares ainda não elucidaram esses mecanismos. Particularmente, em relação à Doença de Chagas, poucos são os estudos que focam na elucidação do processamento do mRNAs na doença e nos fatores que co-regulam a proteína COX-2. Sendo assim, objetivou se nesse estudo analisar os moduladores do processo pró-inflamatório/ hipertrófico em células H9c2 infectadas pela cepa Berenice-62 do T.cruzi, buscando a caracterização de marcadores moleculares do processo inicial da Doença de Chagas. Para isso, os tempos de infecção de 0, 2, 6, 12, 24 e 48 horas foram estudados, logo após 2 horas de interação com o parasito. A comprovação da infectividade foi feita por ensaios de microscopia pela coloração com Giemsa e Dapi. A análise transcricional de genes correlatos ao processo inflamatório/ hipertrófico e de microRNAs foram realizados por ensaios de qRT-PCRs e as análises das proteínas COX-2, PTEN, P-PTEN foram investigadas nos ensaios de Western blots. Outros ensaios bioquímicos, como o de viabilidade celular e o de mensuração de prostaglandina E2, foram realizados. Com os resultados, conclui-se que a infecção com a cepa Be-62 diminui a viabilidade celular após 48 horas de infecção e modula os níveis de expressão dos marcadores de hipertrofia cardíaca Anf, Bnp e β –myhc, além de modular o ambiente pró-inflamatório nos intervalos iniciais de infecção, considerando-se o aumento da expressão e da atividade da proteína COX-2 e no aumento na produção de PGE2. Os resultados também demonstraram uma relação entre os genes Cox-2, Pten, Akt, sugerindo uma possível correlação cruzada entre COX-2 e PTEN. Os microRNAs-26b, -463,-1 e -21, respectivamente, indicaram uma possível regulação pós-traducional das proteínas COX-2 e PTEN, demonstrando um papel fundamental na instalação do quadro de hipertrofia. Estudos futuros poderão validar o papel dessas moléculas como marcadores moleculares e espera-se que os resultados do presente estudo possam direcionar a caracterização de moléculas que auxiliem no prognóstico e tratamento da doença de maneira direcionada, considerando-se a grande variabilidade genética das cepas do T. cruzi.
Análise dos efeitos do tratamento com o heptapeptídeo angiotensina-(1-7) no controle do processo pró-inflamatório tumoral e na modulação de COX-2 e PTEN em células A549.
(2014) Silva, Andréa Renata da; Moraes, Karen Cristiane Martinez de
Mundialmente, entre os diferentes tipos de tumores, o câncer de pulmão se destaca como um grave problema de saúde pública. Na busca por terapias inovadoras, várias moléculas estão sendo estudadas, neste contexto, insere-se a Angiotensina-(1-7), que possui propriedades vasodilatadoras, anti-angiogênicas, anti-trombóticas e anti-proliferativas. Recentemente, a Ang-(1-7) vem sendo descrita como um candidato potencial para modular os níveis da proteína ciclooxigenase-2 (COX-2). A enzima COX-2, assume posição de destaque na regulação dos mecanismos moleculares associados ao processo pró-inflamatório tumoral, sendo super-expressa em tumores de pulmão. Outro componente importante no desenvolvimento do processo pró-inflamatório tumoral é a proteína fosfatase e tensina homóloga (PTEN), que em tumores apresenta-se frequentemente deletada e/ou mutada; sendo relacionada por diversos autores com os níveis de expressão da proteína COX-2 em tumores, via modulação da atividade de PI3K/AKT. Baseado nas informações disponíveis na literatura, neste trabalho, procurou-se estabelecer um modelo celular com a finalidade de melhor entender a associação entre os níveis de expressão das proteínas COX-2 e PTEN; e também avaliar o envolvimento de pequenas moléculas reguladoras da expressão gênica destas proteínas. Para isso células A549 foram tratadas com Ang-(1-7) 10-7 M por diferentes intervalos de tempo, e logo após foram realizados ensaios de mensuração de lactato e pH, mensuração da atividade de COX-2, análises da expressão dos transcritos e proteínas COX-2 e PTEN; expressão de microRNAs envolvidos na modulação da expressão de COX-2, PTEN e FOXO-1; análise de expressão gênica de FOXO-1 e das proteínas de adesão Claudina, EPCAM e Integrina _-8. Como resultado, observou-se que o tratamento com Ang-(1-7) induz alterações celulares, dentre elas, um efeito negativo no metabolismo tumoral da linhagem celular A549, diminuindo a produção de ácido lático, elevando assim o pH extracelular; apesar de modular a expressão das proteínas COX-2 e PTEN, não foi identificada uma associação; analisando os miRNAs, não foi possível mostrar uma associação entre estas pequenas moléculas e a expressão de COX-2 e PTEN; Ang-(1-7) promove modulação dos níveis de expressão das proteínas de adesão e FOXO-1, sendo identificada uma sincronia entre o padrão de expressão de FOXO-1 e dos genes das proteínas de adesão investigadas Claudina-1 e EPCAM.
Cyclic adenosine monophosphate protects renal cell lines against amphotericin B toxicity in a PKA-independent manner.
(2015) Ferreira, Andrea da Fonseca; França, Flávia Dayrell; Rossoni Júnior, Joamyr Victor; Moraes, Karen Cristiane Martinez de; Gomes, Dawidson Assis; Costa, Daniela Caldeira; Tagliati, Carlos Alberto; Chaves, Míriam Martins
Amphotericin B is the ‘‘gold standard’’ agent in the management of serious systemic fungal infections. However, this drug can cause nephrotoxicity, which contributes up to 25% of all acute kidney injuries in critically ill patients. Cyclic adenosine monophosphate can protect kidney cells from death due to injury or drug exposure in some cases. Hence, the objective of this work was to evaluate if cAMP could prevent cell death that occurs in renal cell lines subjected to AmB treatment and, if so, to assess the involvement of PKA in the transduction of this signal. Two different renal cell lines (LLC-PK1 and MDCK) were used in this study. MTT and flow cytometry assays showed increased cell survival when cells were exposed to cAMP in a PKA-independent manner, which was confirmed by western blot. This finding suggests that cAMP (db-cAMP) may prevent cell death caused by exposure to AmB. This is the first time this effect has been identified when renal cells are exposed to AmB’s nephrotoxic potential.
Efeito da Angiotensina-(1-7) na função moduladora do miRNA-1914-5p e elementos reguladores do metabolismo de lipídio no processo fibrosante hepático em células LX-2.
(2017) Silva, Brenda de Oliveira da; Moraes, Karen Cristiane Martinez de; Moraes, Karen Cristiane Martinez de; Torsoni, Adriana Souza; Freitas, Renata Nascimento de; Alves, Stênio Nunes; Borges, William de Castro
A fibrose hepática é o mecanismo de cicatrização e reparo do fígado quando este sofre algum tipo de lesão. Entre os elementos que atuam metabolicamente no desenvolvimento da fibrogênese hepática temos a célula estrelada hepática e esta pode ser encontrada em dois fenótipos: quiescente e ativado. Atualmente existem poucas opções eficazes na reversão do quadro fibrótico e além disso, os detalhes dos mecanismos moleculares da fisiopatologia da fibrose não são bem conhecidos. Assim, elucidar particularidades moleculares, bioquímicas e fisiológicas deste processo torna-se crucial no desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas. Particularmente, a linhagem celular humana, LX-2, vem sendo utilizada como um modelo de estudo da fibrose hepática e, interessantemente, o peptídeo Angiotensina-(1-7) [Ang-(1-7)] se desponta como um importante regulador da pressão arterial, da homeostasia dos fluidos e alguns estudos apontam o seu efeito modulador no processo fibrosante hepático. Dentro do contexto, miRNAs vêm se tornando um novo alvo de investigação e representam uma nova possibilidade de terapia. Diante do exposto, o presente trabalho investigou elementos moduladores do metabolismo de lipídio e da transdiferenciação da célula hepática estrelada LX-2cultivadas sob diferentes condições em diferentes condições: quiescente, ativada, tratadas com Ang-(1-7) e transfectadas com inibidor e mímico do miR-1914-5p. As análises de microscopia e de expressão gênica apontam uma forte conexão dos efeitos moduladores da Ang-(1-7) para regulação do processo fibrosante, via atuação sistêmica no metabolismo lipídico, pela funcionalidade do miR- 1914-5p. Em resumo, os resultados reforçam a contribuição da Angiotensina-(1-7) na reversão do processo fibrosante hepático LX-2 com destaque-se para o miR-1914-5p como uma molécula expoente nesse controle.
Estabelecimento de um modelo celular para o estudo de hipertrofias cardíacas mediadas pela inflamação : o papel de peptídeos vasoativos na modulação de COX-2 e PTEN.
(2013) Silva, Walmir da; Moraes, Karen Cristiane Martinez de
Trabalhos recentes têm demonstrado a importância do Sistema Renina-Angiotensina (SRA) na modulação das hipertrofias cardíacas e atenção especial vem sendo dada aos peptídeos vasoativos, Angiotensina II (Ang II) e a Angiotensina-(1-7) [Ang-(1-7)], devido aos seus efeitos antagônicos nas hipertrofias, além do envolvimento destes na modulação dos níveis da enzima ciclooxigenase-2 (COX-2), importante na produção de Prostaglandina E2 (PGE2), que direta ou indiretamente está envolvida com a resposta hipertrófica cardíaca quando mediada pela inflamação. Outro importante elemento no desenvolvimento do processo inflamatório crônico é a proteína supressora tumoral PTEN. Em tumores, onde a inflamação crônica esta presente, alguns estudos correlacionam a diminuição dos níveis de PTEN com a modulação da proteína COX-2, entretanto esta correlação ainda é obscura. Assim, no presente estudo, considerando-se um paralelismo molecular existente entre o processo inflamatório tumoral e os mecanismos hipertróficos/ inflamatórios cardíacos nós focamos nos processos de co-regulação de PTEN e COX-2 em cultura de células cardíacas tratadas com os peptídeos vasoativos Ang II e Ang-(1-7), visando a caracterização de marcadores moleculares e um futuro desenvolvimento de fármacos. Nossos resultados mostraram que as concentrações utilizadas dos peptídeos vasoativos não foram citotóxicas para o nosso modelo de estudo. Frente aos tratamentos, a análise da expressão gênica realizada através de reações de polimerização em cadeia (PCR) focou-se nos genes Cox-2, Pten, fatores transcricionais, marcadores de hipertrofia, assim como outros elementos correlacionados ao nosso modelo de estudo. Paralelamente, as análises proteícas por Western blot, demonstraram uma possível correlação entre COX-2 e PTEN quando da utilização do peptídeo Ang II. Baseado nessa observação, procuramos ainda analisar um possível mecanismo de regulação pós-transcricional, pela análise da expressão miRNAs nas culturas cardíacas estimuladas com a Ang II. Em conjunto os resultados deste trabalho demonstram que há um possível mecanismo de corregulação entre COX-2 e PTEN, além do possível envolvimento dos miR-26a e miR-26b na regulação dos níveis de PTEN, mostrando que o modelo celular estabelecido é funcional pra estudo das hipertrofias cardíacas mediado pela inflamação e colaborará com as etapas subsequentes na caracterização de marcadores moleculares como potenciais alvos terapêuticos.
Regulação do transporte de lactose em Kluyveromyces lactis JA6.
(2013) Santos, Ana Maria dos; Castro, Ieso de Miranda; Moraes, Karen Cristiane Martinez de; Borges, William de Castro
Kluyveromyces lactis é uma levedura capaz de fermentar a lactose e por isso é considerada como modelo alternativo para estudos bioquímicos, fisiológicos e genéticos de leveduras não Saccharomyces. Compreender os mecanismos de captação de lactose e a regulação envolvida no transporte é um passo importante para melhores aplicações biotecnológicas destas células. O transporte de lactose, em K. lactis é mediado por uma permease da membrana, codificada pelo gene LAC12. Nesse estudo as estirpes utilizadas foram a K. lactis JA6 e a K. lactis JA6 LAC12-GFP. As células foram cultivadas em meio YNB completo, suplementado com diferentes fontes de carbono (lactose, galactose, glicose e glicerol (3% w/w)) a uma concentração de 2% (w / v), em uma incubadora orbital a 30 ° C. As células foram colhidas no meio de fase exponencial, lavadas por três vezes com água fria, resuspensas em 100 mM Tris / tampão de citrato, pH 5.0 para medições de transporte de [D-glucose-1-14C] lactose. A cinética da taxa inicial de captação de [D-glucose-1-14] lactose foi investigada numa gama de concentrações de 0,025 a 10 mM de lactose. Galactose foi testada como inibidor competitivo do transporte de lactose, uma vez que em K. lactis Lac12p também foi descrito como transportador de galactose. Para estudar o efeito da glicose no transporte de lactose, as células foram cultivadas em lactose e divididas em duas alíquotas (controlo e 100 mM de glicose adicionada). As células foram colhidas, lavadas e a captação inicial de lactose foi medida. A taxa de captação inicial de [D-glucose-1-14C] lactose também foi investigada em células cultivadas em glicose e transferidas para lactose na presença / ausência de cicloheximida ou Higromicina B. A localização do transportador Lac12-GFP foi investigada em células crescidas em glicose e em células transferidas para lactose, ou galactose, ou glicerol. O perfil de consumo de açúcares por células de K.lactis foi analisado através de HPLC. Os resultados mostraram que o transporte de lactose em células cultivadas em 2% de lactose obedece a uma cinética de saturação. A constante de afinidade (Ks) foi de 1,49 ± 0,38 mM e a velocidade máxima (Vmáx) foi 953,47 ± 116,24 μmoles.h-1.g-1. O mesmo sistema de transporte estava presente em células cultivadas em galactose e glicerol. As células cultivadas em 2% (w/v) de glicose transportaram a lactose em taxas muito baixas. No entanto, quando as células crescidas em glicose foram transferidas para 2% (w/v) de lactose, o transporte exibe recuperação parcial. Esta recuperação não parece requerer a síntese de proteínas uma vez que cicloheximida e higromicina B não impediram a desrepressão parcial. Além disso, o transporte de lactose não é inativado pela glicose. A localização sub celular do transportador Lac12 é dependente da fonte de carbono e da sua concentração. O consumo de glicose e lactose é simultâneo apesar da glicose retardar o consumo da lactose. O consumo de lactose é preferencial ao de galactose quando os dois açúcares estão presentes simultaneamente. Estes dados nos permitem inferir que o sistema de transporte de lactose em K. lactis JA6 é constitutivo e que a glicose exerce um controle não muito claro no transporte lactose. Provavelmente, este controle envolve mecanismos transcricionais e postranscricional.
Role of cyclooxygenase-2 in Trypanosoma cruzi survival in the early stages of parasite host-cell interaction.
(2015) Moraes, Karen Cristiane Martinez de; Diniz, Lívia de Figueiredo; Bahia, Maria Terezinha
Chagas disease, caused by the intracellular protozoan Trypanosoma cruzi, is a serious health problem in Latin America. During this parasitic infection, the heart is one of the major organs affected. The pathogenesis of tissue remodelling, particularly regarding cardiomyocyte behaviour after parasite infection and the molecular mechanisms that occur immediately following parasite entry into host cells are not yet completely understood. When cells are infected with T. cruzi, they develop an inflammatory response, in which cyclooxygenase-2 (COX-2) catalyses rate-limiting steps in the arachidonic acid pathway. However, how the parasite interaction modulates COX-2 activity is poorly understood. In this study, the H9c2 cell line was used as our model and we investigated cellular and biochemi¬cal aspects during the initial 48 h of parasitic infection. Oscillatory activity of COX-2 was observed, which correlated with the control of the pro-inflammatory environment in infected cells. Interestingly, subcellular trafficking was also verified, correlated with the control of Cox-2 mRNA or the activated COX-2 protein in cells, which is directly con¬nected with the assemble of stress granules structures. Our collective findings suggest that in the very early stage of the T. cruzi-host cell interaction, the parasite is able to modulate the cellular metabolism in order to survives.
Role of protein kinase A signaling pathway in cyclosporine nephrotoxicity.
(2014) França, Flávia Dayrell; Ferreira, Andrea da Fonseca; Lara, R. C.; Rossoni Júnior, Joamyr Victor; Costa, Daniela Caldeira; Moraes, Karen Cristiane Martinez de; Gomes, Dawidson Assis; Tagliati, Carlos Alberto; Schultz, Míriam Chaves
Cyclosporine is an important immunosuppressive agent; however, nephrotoxicity is one of the main adverse effects. The purpose of this study was to evaluate the effect of inhibiting the protein kinase A (PKA) signaling pathway in nephrotoxicity caused by cyclosporine from the assessment of cell viability, pro-inflammatory cytokines, and nitric oxide (NO) production in LLC-PK1 and MDCK cell lines. Cyclosporine proved to be cytotoxic for both cell lines, as assessed by the mitochondrial enzyme activity assay (MTT), caused DNA fragmentation, determined by flow cytometry using the propidium iodide dye, and activated the PKA pathway (western blot assay). In MDCK cells, the inhibition of the PKA signaling pathway (H89 inhibitor) caused a significant reduction in DNA fragmentation. In both cell lines, the production of IL-6 proved to be a dependent PKA pathway, while TNF-a was not influenced by the inhibition of the PKA pathway. The NO production was increased when cells were pre-incubated with H89 followed by cyclosporine, and this production was dependent on the PKA pathway in LLC-PK1 and MDCK cells lines. Therefore, considering the present study’s results, it can be concluded that the inhibition of PKA signaling pathway can aid in reducing the degree of nephrotoxicity caused by cyclosporine.