Navegando por Autor "Castanheira, Diogo Dias"

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Detailed search for protein kinase(s) involved in plasma membrane H+-ATPase activity regulation of yeast cells.
(2015) Pereira, Renata Rebeca; Castanheira, Diogo Dias; Teixeira, Janaina Aparecida; Bouillet, Leoneide Érica Maduro; Ribeiro, Erica Milena de Castro; Trópia, Maria José Magalhães; Alvarez, Florencia; Correa, Lygia Fátima da Mata; Mota, Bruno Eduardo Fernandes; Conceição, Luís Eduardo Fernandes Rodrigues da; Castro, Ieso de Miranda; Brandão, Rogélio Lopes
This study displays a screening using yeast strains deficient in protein kinases known to exist in Saccharomyces cerevisiae. From 95 viable single mutants, 20 mutants appear to be affected in the glucose-induced extracellular acidification. The mutants that are unaffected in calcium signaling were tested for their sensitivity to hygromycin B. Furthermore, we verified whether the remaining mutants produced enzymes that are appropriately incorporated at plasma membrane. Finally, we measure the kinetic properties of the enzyme in purified plasma membranes from glucose-starved as well as glucose-fermenting cells. We confirmed the kinase Ptk2 involvement in H+−ATPase regulation (increase of affinity for ATP). However, the identification of the kinase(s) responsible for phosphorylation that leads to an increase in Vmax appears to be more complex. Complementary experiments were performed to check how those protein kinases could be related to the control of the plasma membrane H+−ATPase and/or the potential membrane. In summary, our results did not permit us to identify the protein kinase(s) involved in regulating the catalytic efficiency of the plasma membrane H+−ATPase. Therefore, our results indicate that the current regulatory model based on the phosphorylation of two different sites located in the C-terminus tail of the enzyme could be inappropriate.
Estudos sobre a produção de etanol em células de Saccharomyces cerevisiae com maior atividade da enzima H+-ATPase de membrana citoplasmática.
(Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós Graduação, Universidade Federal de Ouro Preto., 2013) Castanheira, Diogo Dias; Brandão, Rogélio Lopes
Etanol, uma fonte de energia renovável, pode ser considerado como uma boa alternativa para substituir os combustíveis fósseis. Atualmente, o continente americano é o maior produtor mundial de etanol, com Estados Unidos e Brasil sendo os maiores produtores mundiais. O objetivo deste trabalho foi estudar a produção de etanol em células de Saccharomyces cerevisiae com maior atividade da enzima H+-ATPase de membrana citoplasmática. Neste trabalho, inicialmente avaliou-se a produção de etanol em cepas de S. cerevisiae que apresentavam alteração na atividade da H+-ATPase de membrana citoplasmática, selecionando-se as cepas PJ69 (selvagem) e arg82Δ. As cepas foram transformadas com plasmídeos contendo o gene PMA1 (que codifica para a H+-ATPase) contendo modificações para tornar a enzima constitutivamente ativada. Nenhuma das cepas transformadas apresentou alteração quanto aos parâmetros de crescimento ou aumento da atividade enzimática. As cepas foram crescidas em meio contendo sacarose como fonte de carbono, em diferentes concentrações (2, 4, 8 e 15%). A cepa PJ69 apresentou uma maior produção de etanol e maior consumo de sacarose nas concentrações de 8 e 15% comparada à arg82Δ. O metabolismo de sacarose foi avaliado através da atividade invertásica e também pelo transporte desse açúcar. As cepas PJ69 e arg82Δ não diferiram com relação ao transporte de sacarose, entretanto a cepa selvagem mostrou maior atividade invertásica. A quantificação de ATP intracelular nas cepas PJ69 e arg82Δ crescidas em glicose mostrou que, na fase exponencial e na estacionária, a cepa arg82Δ contém seis vezes mais ATP que a cepa selvagem. Em sacarose, o conteúdo de ATP de arg82Δ também foi maior, sendo 1,1 e 1,5 vezes maior que a PJ69, nas fases exponencial e estacionária respectivamente. Em fermentação com alta concentração de glicose (15% p/v), as duas cepas produziram ao final do processo, concentrações similares de etanol, porém, a cepa arg82Δ levou o dobro do tempo da cepa PJ69 para atingir a mesma concentração de etanol.
Lpx1p links glucose-induced calcium signaling and plasma membrane H+-ATPase activation in Saccharomyces cerevisiae cells.
(2017) Castanheira, Diogo Dias; Santana, Eduardo Perovano; Santos, Fernanda Godoy; Diniz, Raphael Hermano Santos; Oliveira, Fábio Faria; Pereira, Renata Rebeca; Trópia, Maria José Magalhães; Castro, Ieso de Miranda; Brandão, Rogélio Lopes
In yeast, as in other eukaryotes, calcium plays an essential role in signaling transduction to regulate different processes. Many pieces of evidence suggest that glucose-induced activation of plasma membrane H+-ATPase, essential for yeast physiology, is related to calcium signaling. Until now, it was not identified any protein that could be regulated by calcium in this context. Lpx1p, a serine-protease that is also involved in the glucose-induced activation of the plasma membrane H+-ATPase activation, could be a candidate to respond to intracellular calcium signaling involved in this process. In this work, and by using different approaches, we showed many pieces of evidence suggesting that the requirement of calcium signaling for activation of the plasma membrane H+-ATPase is due to its requirement for activation of Lpx1p. According to the current model, activation of Lpx1p would cause hydrolysis of an acetylated tubulin that keeps the plasma membrane H+-ATPase in an inactive state. Therefore, after its activation, Lpx1p would hydrolyze the acetylated tubulin making the plasma membrane H+-ATPase phosphorylation accessible for at least one protein kinase.
A proteína Lpx1 como elo entre a sinalização de cálcio intracelular e a ativação de H+-ATPase de membrana citoplasmática, induzidas por glicose, em Saccharomyces cerevisiae.
(2018) Castanheira, Diogo Dias; Brandão, Rogélio Lopes; Santos, Fernanda Godoy; Diniz, Raphael Hermano Santos; Brandão, Rogélio Lopes; Ulhoa, Cirano José; Fietto, Luciano Gomes; Isoldi, Mauro César; Andrade, Milton Hércules Guerra de
Em leveduras, como em outros eucariotos, o cálcio desempenha um papel essencial nas vias de sinalização celular. No entanto, até agora, a influência do cálcio na ativação de H+-ATPase de membrana citoplasmática induzida por glicose, uma via essencial para a fisiologia de leveduras, não foi demonstrada apesar de muitas evidências sugerirem que o cálcio é um fator primordial envolvido na ativação de H+-ATPase. H+-ATPase é uma proteína de membrana citoplasmática essencial para criar um gradiente de H+, utilizado para o transporte de nutrientes e homeostase do pH. A ativação de H+-ATPase é regulada pela atividade de diferentes proteínas como proteases, quinases e canais iônicos. Neste trabalho, foi demonstrada a relação entre a atividade de Lpx1p, uma serino-protease essencial para a ativação induzida por glicose de H+-ATPase de membrana citoplasmática, e o cálcio. Mutantes lpx1Δ exibiram um sinal de cálcio intracelular que não foi afetado enquanto a atividade de bombeamento de prótons foi reduzida, indicando sua essencialidade na ativação de H+-ATPase. Além disso, o aumento da atividade de bombeamento de prótons foi observado quando Lpx1p foi expresso em células lpx1Δ por meio de um vetor de expressão induzível. Em testes in vitro, a atividade proteolítica de Lpx1p aumentou na presença de cálcio. Dos ensaios in vitro, estabelecidos neste trabalho, foi demonstrado que Lpx1p, Ptk2p e cálcio são elementos-chave para a ativação de H+- ATPase. Esses resultados fortalecem um modelo em que a ativação pós-traducional de H+-ATPase induzida pela glicose e a sinalização de cálcio intracelular, estão realmente conectadas. Lpx1p seria este elo, aparentemente, dependendo da presença de cálcio para ser ativada e hidrolisar tubulinas acetiladas ligadas à H+-ATPase, permitindo a liberação da cauda C-terminal para fosforilação e ativação.