Navegando por Autor "Barbosa, Patrícia Gonçalves Prates"

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Análise de QTL e gênomica comparativa para estudar mecanismos regulatórios da H+ -ATPASE de membrana plasmática de Saccharomyces cerevisiae.
(2021) Barbosa, Patrícia Gonçalves Prates; Brandão, Rogélio Lopes; Cunha, Aureliano Claret da; Cruz, Izinara Rosse da; Brandão, Rogélio Lopes; Fietto, Luciano Gomes; Mendes, Tiago Antônio de Oliveira; Andrade, Milton Hércules Guerra de; Silva, Silvana de Queiroz
A H+ -ATPase é uma proteína presente na membrana citoplasmática de plantas e fungos e desempenha um papel essencial na geração de um gradiente eletroquímico de prótons, importante para a captação de nutrientes e regulação do pH intracelular. A ativação da H + -ATPase da membrana citoplasmática em Saccharomyces cerevisiae induzida por glicose é supostamente atribuída a um sinal de cálcio intracelular correlacionado ao metabolismo do fosfatidilinositol. Em estudos anteriores do nosso grupo de pesquisa, foi observada diferença de fenótipo entre as cepas S. cerevisiae BY4742 arg82Δ e PJ69 arg82Δ através do teste de atividade da H + -ATPase, indicando que o fenótipo de maior ativação da H + -ATPase está relacionado a vários genes. Diante do exposto, o objetivo deste trabalho foi utilizar diferentes abordagens genômicas para identificar novos componentes da regulação induzida por glicose da H + -ATPase. Para isso, foram realizados o sequenciamento do genoma segregante agrupado, mapeamento de QTLs e análises de Bioinformática para identificar o possível motivo da diferença de fenótipo e, ou, novos componentes desta via de transdução de sinal. Uma vez identificadas as variantes na análise de mapeamento de QTL foi desenvolvido o script SNPsInQTLselection.py para identificar as bases genéticas que podem estar envolvidas com o fenótipo de maior atividade da H+ -ATPase. Após a utilização desse script foram identificadas 42 variantes em 33 genes potencialmente envolvidos com o fenótipo de interesse. Para priorização desses genes candidatos foi realizado análise de enriquecimento e interatoma que permitiram identificar 10 genes enriquecidos e envolvidos na via da telomerase e do fosfatidilinositol (STT4, PIK2, UGA2, EST1, MEC3, HEK2, TOP3, PSO2, STO1, FUR4). Cepas do background BY contendo essesrespectivos genes deletados (coleção EUROSCARF) foram utilizadas para teste de fenótipo de acidificação extracelular e sinalização de cálcio induzida por glicose. Por meio desses testes, 4 (UGA2, FUR4, EST1 e STT4) dos 10 genes enriquecidos, apresentaram o fenótipo de maior ativação da H+ -ATPase, fenótipo esse evidenciado nos testes de acidificação extracelular e sinal de cálcio. Destes 4 genes, vale destacar o STT4 visto que, de acordo com a função descrita para esse gene na literatura o fosfatidilinositol-4-fosfato pode exercer um papel na regulação da via de ativação de H + -ATPase, controlando a atividade da fosfolipase C. Tendo em vista uma relação positiva entre atividade da H + - ATPase e desempenho fermentativo, estudos futuros podem ser feitos com os genes/alelos identificados neste trabalho, com aplicação em cepas de leveduras industriais visando a melhoria na eficiência de processos fermentativos. Os genes (UGA2, FUR4, EST1 e STT4) merecem investigação detalhada para verificação do possível envolvimento na via de sinalização da H+ -ATPase. Esse trabalho apresenta pela primeira vez uma estratégia de Bioinformática para identificar genes candidatos quando o resultado do mapeamento de QTL não for significativo.
Análises de QTL e genômica comparativa para estudar mecanismos regulatórios da H+-ATPase de membrana.
(2021) Barbosa, Patrícia Gonçalves Prates; Brandão, Rogélio Lopes; Cunha, Aureliano Claret da; Cruz, Izinara Rosse da; Brandão, Rogélio Lopes; Fietto, Luciano Gomes; Mendes, Tiago Antônio de Oliveira; Andrade, Milton Hércules Guerra de; Silva, Silvana de Queiroz
A H+ -ATPase é uma proteína presente na membrana citoplasmática de plantas e fungos e desempenha um papel essencial na geração de um gradiente eletroquímico de prótons, importante para a captação de nutrientes e regulação do pH intracelular. A ativação da H + -ATPase da membrana citoplasmática em Saccharomyces cerevisiae induzida por glicose é supostamente atribuída a um sinal de cálcio intracelular correlacionado ao metabolismo do fosfatidilinositol. Em estudos anteriores do nosso grupo de pesquisa, foi observada diferença de fenótipo entre as cepas S. cerevisiae BY4742 arg82Δ e PJ69 arg82Δ através do teste de atividade da H + -ATPase, indicando que o fenótipo de maior ativação da H + -ATPase está relacionado a vários genes. Diante do exposto, o objetivo deste trabalho foi utilizar diferentes abordagens genômicas para identificar novos componentes da regulação induzida por glicose da H + -ATPase. Para isso, foram realizados o sequenciamento do genoma segregante agrupado, mapeamento de QTLs e análises de Bioinformática para identificar o possível motivo da diferença de fenótipo e, ou, novos componentes desta via de transdução de sinal. Uma vez identificadas as variantes na análise de mapeamento de QTL foi desenvolvido o script SNPsInQTLselection.py para identificar as bases genéticas que podem estar envolvidas com o fenótipo de maior atividade da H+ -ATPase. Após a utilização desse script foram identificadas 42 variantes em 33 genes potencialmente envolvidos com o fenótipo de interesse. Para priorização desses genes candidatos foi realizado análise de enriquecimento e interatoma que permitiram identificar 10 genes enriquecidos e envolvidos na via da telomerase e do fosfatidilinositol (STT4, PIK2, UGA2, EST1, MEC3, HEK2, TOP3, PSO2, STO1, FUR4). Cepas do background BY contendo essesrespectivos genes deletados (coleção EUROSCARF) foram utilizadas para teste de fenótipo de acidificação extracelular e sinalização de cálcio induzida por glicose. Por meio desses testes, 4 (UGA2, FUR4, EST1 e STT4) dos 10 genes enriquecidos, apresentaram o fenótipo de maior ativação da H+ -ATPase, fenótipo esse evidenciado nos testes de acidificação extracelular e sinal de cálcio. Destes 4 genes, vale destacar o STT4 visto que, de acordo com a função descrita para esse gene na literatura o fosfatidilinositol-4-fosfato pode exercer um papel na regulação da via de ativação de H + -ATPase, controlando a atividade da fosfolipase C. Tendo em vista uma relação positiva entre atividade da H + - ATPase e desempenho fermentativo, estudos futuros podem ser feitos com os genes/alelos identificados neste trabalho, com aplicação em cepas de leveduras industriais 8 visando a melhoria na eficiência de processos fermentativos. Os genes (UGA2, FUR4, EST1 e STT4) merecem investigação detalhada para verificação do possível envolvimento na via de sinalização da H+ -ATPase. Esse trabalho apresenta pela primeira vez uma estratégia de Bioinformática para identificar genes candidatos quando o resultado do mapeamento de QTL não for significativo.
Obtenção e seleção de segregantes através da técnica BSA - bulk segregants analysis com maior ativação da H+-ATPase de membrana citoplasmática a partir de linhagem Saccharomyces cerevisiae PJ694a.
(2016) Barbosa, Patrícia Gonçalves Prates; Brandão, Rogélio Lopes; Saraiva, Margarete Alice Fontes; Castro, Ieso de Miranda; Fietto, Luciano Gomes; Brandão, Rogélio Lopes
A H+-ATPase de membrana citoplasmática de Saccharomyces cerevisiae mantem o gradiente eletroquímico necessário para o transporte de íons, de nutrientes essenciais e pelo controle do pH interno. A ativação da H+-ATPase da membrana citoplasmática em S. cerevisiae induzida pela glicose é dependente de cálcio e o metabolismo do fosfatidilinositol parece estar envolvida neste processo de ativação da enzima. A proteína Arg82 p é uma inositol quinase que tem como uma das suas funções fosforilar o inositol 1,4,5-trifosfato (IP3) em inositol 1,3,4,5-tetrafosfato (IP4) e inositol 1,3,4,5,6-pentafosfato (IP5) considerados importantes mensageiros na regulação da homeostase de Ca2+ citosólico. O mutante arg82 da linhagem de S. cerevisiae PJ69 apresenta uma atividade da H+-ATPase superior a linhagem selvagem, indicando uma relação da ausência dessa proteína com o aumento nas concentrações de IP3 e de cálcio citosólico com subsequente ativação da H+-ATPase. Curiosamente, esse efeito não é observado com o mesmo mutante obtido para a linhagem BY4742. Para estudar essa aparente contradição foram realizados cruzamentos o mutante arg82 do background PJ69 (apresentando maior ativação da Pma1 p induzida por glicose) e a estirpe selvagem do background BY4742 (com menor ativação da Pma1), com posterior seleção de segregantes que possuem os fenótipos similares ao da linhagem parental superior (arg82 do background PJ69). Após cruzamento dessas linhagens, 600 segregantes F1 foram testados quanto à suscetibilidade ao antibiótico higromicina e ao cloreto de lítio. Aproximadamente 34 segregantes que apresentaram comportamento similar ao parental superior foram selecionados para análise da acidificação induzida por glicose para confirmação da maior ativação da H+-ATPase induzida por glicose. Dentre esses segregantes, vinte com fenótipo superior podem ser utilizados para o mapeamento de QTLs relacionados à maior ativação da H+-ATPase induzida por glicose na linhagem S. cerevisiae PJ694a.